CYP2C8代谢紫杉醇产物6α—羟基紫杉醇的LC—MS/MS检测

黄洁琼

【摘 要】本文以紫杉醇为底物，建立其CYP2C8代谢产物6α-羟基紫杉醇的LC-MS/MS方法，为CYP2C8酶活性的研究提供可靠、灵敏、快速的检测分析方法。采用电喷雾离子源（ESI），三级四级杆串联质谱，多级反应监测进行定量，正离子扫描，选取离子对为6α-羟基紫杉醇892.3→308.1；内标多西紫杉醇830.3→549.4。利用Agela Venusil XBP C18 色谱柱（50×2.1mm；5μm）实现代谢物分离，柱温40℃，流速为0.3mL/min，流动相为A相（水∶乙腈=95∶5）与B相（水∶乙腈=5∶95）梯度混合。代谢物6α-羟基紫杉醇与内标实现基线分离，峰形良好，而且不存在代谢与内标之间的干扰，且6α-羟基紫杉醇在5-500ng/ml的范围为线性关系良好；该方法快速灵敏可用于CYP2C8活性检测。

【关键词】紫杉醇；CYP2C8；LC-MS

细胞色素P450酶（CYP450）是存在于细胞内质网上的蛋白质超家族，它对多种内源性、外源性物质在体内的氧化反应起着重要的作用，是药物动力学和反应的变化的一个主要原因。在推定的57个有功能的人类细胞色素P450中，只有属于CYP1、CYP2、CYP3这三个家族的大约十几个酶对药物的代谢起主要作用，其中包括CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等[1]。其中，CYP2C8是CYP2C家族中最晚发现的一个成员，大约占CYP2C家族的26%。CYP2C8主要分布在肝脏，占肝CYP代谢酶总量的7%；其在肝脏外的组织中也存在少量的分布[2]。CYP2C8参与催化大约5%的临床药物，并且存在着明显的基因多态性，对药物的代谢清除有着明显的影响。

紫杉醇是一种抗微管细胞药物，被广泛应用于治疗卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、头颈部癌等恶性肿瘤[3]。紫杉醇在人体内能够被CYP3A4和CYP2C8代谢，分别生成p-3-羟基紫杉醇和6α-羟基紫杉醇[4-5]。在人肝微粒体中，6α-羟基紫杉醇的生成量高于p-3-羟基紫杉醇，这表明CYP2C8在紫杉醇体内代谢过程中发挥着重要作用[6]。为了研究CYP2C8酶活性则必须要建立快速、可靠、灵敏的检测酶活性方法。本文以紫杉醇为底物，建立其CYP2C8代谢产物6α-羟基紫杉醇的LC-MS/MS方法，为CYP2C8酶活性的研究提供可靠，灵敏，快速的检测分析方法。

1 试剂和仪器

1.1 试剂

甲醇（Merck，德国）；乙腈（Merck，德国）；紫杉醇及其代谢物6α-羟基紫杉醇（BD，美国）；多西紫杉醇（sigma，美国）。

1.2 仪器

液相色谱系统为日本Shimadzu液相色谱系统，包括LC-20AD输液泵，SIL-20A自动进样器以及Shimadzu CTO-20A柱温箱；质谱系统为美国Applied Biosystems公司API 4000 Q TRAP三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（Turbo Ionspray）以及Analyst 1.4.2数据采集软件。

2 底物代谢物LC-MS/MS方法的构建

（1）用甲醇或乙腈将紫杉醇及其代谢产物6α-羟基紫杉醇稀释至约1000ng/mL；

（2）激活Mass only，修改参数，以10μL/min进入质谱仪；

（3）记录相应参数：底物及代谢产物的母离子Q1、子离子Q3、去溶剂电压DP，撞击能量CE；

（4）激活LC/MS，修改参数。选择合适流动相，分别用甲醇或乙腈配制低高两个浓度的代谢产物单样及低、高两个浓度的代谢产物和内标的混合液进样，调整相应参数使得底物，代谢产物及内标实现基线分离并使其系列浓度拥有良好的线性；

（5）清洗管路。

3 结果

通过液相串联质谱对紫杉醇的代谢产物6α-羟基紫杉醇建立专属灵敏的LC-MS/MS方法，进行定量检测。采用正离子模式，选择离子对m/z 892.4→324.1（图1）和m/z 830.3→549.4（图2）分别测定6α-羟基紫杉醇和多西紫杉醇（内标）的含量；色谱图如图3所示，方法总结见表1。代谢物与内标实现基线分离，峰形良好，而且不存在代谢与内标之间的干扰，6α-羟基紫杉醇在5-500ng/ml的范围为线性关系良好。该方法快速灵敏可用于CYP2C8活性检测。

4 结论

本文选取紫杉醇为CYP2C8代谢酶的探针底物，并建立了其主要代谢物6α-羟基紫杉醇的LC-MS方法，代谢物与内标峰形良好，分离度好，且不存在相互干扰，可为评价CYP2C8代谢酶的活性提供灵敏、快速、特征专属的检测方法。

【参考文献】

[1]谢章明.人CYP3A4与POR及cytb_5共表达条件的优化以及表达产物在药物相互作用研究中的应用[D].浙江大学，2013.

[2]Klose TS， Blaisdell JA， Goldstein JA. Gene structure of CYP2C8 and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs[J]. Journal of Biochemical & Molecular Toxicology， 1999，13（6）：289-295.

[3]郭培凤，郭云利.紫杉醇应用相关不良反应观察[J].医学信息，2014（2）：643.

[4]Monsarrat B， Mariel E， Cros S， et al. Taxol metabolism. Isolation and identification of three major metabolites of taxol in rat bile[J]. Drug Metabolism & Disposition， 1990， 18（6）：895-901.

[5]Walle T， Kumar GN， McMillan JM， et al. Taxol metabolism in rat hepatocytes[J]. Biochemcal Pharmacology， 1993，46（9）：1661-1664.

[6]Taniguchi R， Kumai T， Matsumoto N， et al. Utilization of human liver microsomes to explain individual differences in paclitaxel metabolism by CYP2C8 and CYP3A4[J]. Journal of Pharmacological Sciences， 2005，97（1）：83-90.

[责任编辑：王楠]