体外软骨细胞凋亡模型及其介导的信号通路研究进展

周炎，刘世清

(武汉大学人民医院骨科，湖北 武汉 430060)



体外软骨细胞凋亡模型及其介导的信号通路研究进展

周炎，刘世清*

(武汉大学人民医院骨科，湖北 武汉 430060)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种累及关节软骨、软骨下骨质、关节囊及关节周围韧带、滑膜及肌肉的慢性、进展性骨关节疾病，以关节疼痛、肿胀、僵硬及活动受限为主要临床表现。随着人口老龄化日趋严重，OA发病率逐年增加，其所带来的社会问题应引起重视。关节软骨由软骨细胞及软骨基质组成，在正常的生理条件下，软骨细胞具有调节软骨基质合成及降解平衡的生理功能，进而保持关节软骨结构及功能的完整性[1]。目前，国内外学者对OA病因及发病机制进行了大量的科学研究，虽至今仍未完全明确，但在一定程度上达成了共识。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，负责维护和改造细胞外基质结构及功能的完整性，维持软骨内稳态[2]。越来越多的证据表明软骨退变与软骨细胞死亡密切相关，且软骨细胞死亡以凋亡及坏死的形式存在，其中软骨细胞凋亡在OA关节软骨退变的病理学特征中尤为明显，表现为软骨细胞核染色体固缩、DNA碎裂、细胞皱缩、质膜囊泡及凋亡小体形成，同时伴有软骨基质的降解和钙化[3]。软骨细胞凋亡比例与关节软骨破坏及软骨基质损耗程度具有高度一致性，确立了软骨细胞凋亡机制在OA疾病发生、发展过程中的重要作用。本文就近年来体外软骨细胞凋亡模型构建及其介导的信号通路研究进展综述如下。

1 体外诱导软骨细胞凋亡模型

1.1 硝普钠 硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)是一种具有强烈的血管舒张作用的无机盐类，以往临床上多采取静脉注射用于急性高血压的紧急处理。同时，SNP作为一氧化氮(nitric oxide，NO)的供体，可以释放外源性的NO，在OA及类风湿关节炎滑膜及软骨组织中，由一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)诱导产生的NO含量可明显升高，并伴有软骨细胞凋亡、蛋白聚糖和胶原合成降低、基质金属蛋白酶活性增高及关节软骨炎症表现[4]。目前，利用SNP诱导软骨细胞凋亡被广泛运用于OA疾病的基础研究。Wu等[5]报道利用SNP诱导兔软骨细胞凋亡，24h后检测软骨细胞核碎裂、固缩，通过流式检测凋亡率明显增高，线粒体膜电位降低，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性增强。Chen等[6]运用SNP刺激兔关节软骨细胞后，通过扫描电镜观察软骨细胞皱缩，呈圆形态，细胞溶解或分离，流式细胞检测凋亡明显增加，线粒体膜电位降低，检测培养基上清液前列腺素E2表达水平升高。我们之前的研究亦运用SNP诱导大鼠软骨细胞凋亡，软骨细胞活力明显降低，可诱导软骨细胞进行骨架改建，iNOS及caspase-3蛋白表达升高，是较为理想的软骨细胞凋亡诱导剂[7]。同时需注意，SNP溶液相对不稳定，储存时间过长或见光容易分解，影响药物活性，遂建议避光保存，并尽可能新鲜配置使用。

1.2 白介素(interleukin，IL)-1β IL-1β作为关节软骨退变过程中最直接的促炎细胞因子，可促进前列腺素E的合成，刺激NO、过氧化物及过氧亚硝基等多种活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，进而促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)高表达，抑制组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成，诱导软骨细胞凋亡，常作为构建体外及体内OA模型的诱导剂[8]。Zheng等[9]报道应用IL-1β(10 ng/mL)体外诱导大鼠软骨细胞凋亡，24 h后检测细胞活力明显降低，且胞核固缩及裂解现象明显，蛋白印迹检测软骨细胞MMP-13含量升高，同时TIMP-1、Bcl-2及Bcl-xl含量降低。Kimura等[10]运用IL-1β体外可刺激牛科鼻部软骨中蛋白多糖和胶原蛋白的释放，促进关节软骨细胞MMP-13的产生，同时IL-1β可促进软骨细胞NO的表达，诱导软骨细胞凋亡病理改变。Ju等[11]报道利用IL-1β刺激兔关节软骨细胞后出现DNA碎裂，软骨细胞凋亡比例明显升高，同时caspase-3活性增强。

1.3 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α TNF-α是OA关节软骨退变发生过程中重要的介质，可促进关节滑膜及软骨细胞中细胞因子及趋化因子的表达，诱导软骨细胞产生MMPs，使得软骨中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖含量降低[12]。多项研究证实TNF-α可促进软骨细胞凋亡，并与caspase家族成员密切相关。Guo等[13]运用酶免疫分析法测量外科手术构建OA模型兔血清中TNF-α含量，结果显示TNF-α含量较正常对照组明显增高，同时软骨组织中caspase-3及caspase-8表达与TNF-α含量呈现正相关系。Guo等[14]报道分别运用IL-1β(10 ng/mL)及TNF-α(5 ng/mL)刺激人关节软骨细胞，可提高内质网(endoplasmic reticulum，ER)未折叠蛋白反应，促进ER应激介导的凋亡途径，导致软骨细胞凋亡，且该反应与ER应激诱导剂引起的效能相当。Lee等[15]报道体外运用TNF-α联合环己酰亚胺诱导大鼠软骨细胞死亡，包括细胞凋亡、自噬性细胞死亡及坏死性凋亡三种形式，环己酰亚胺作为细胞转化抑制剂可以激活软骨细胞，结果表明在两种诱导剂同时作用时，软骨细胞活力明显降低，单独TNF-α或环己酰亚胺均不能导致细胞活力降低，同时可以刺激细胞色素c从线粒体释放到胞质，并通过流式细胞检测凋亡率明显增加，且细胞核固缩、碎裂表现明显，软骨细胞中caspase-3和caspase-7表达增高。

1.4 Fas抗体 Fas也称CD95，属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族，是一种与细胞凋亡密切相关的跨膜蛋白分子。相关研究表明，OA关节软骨中Fas表达较正常软骨明显升高，且Fas表达集中在软骨病变区域内，Fas抗体与细胞表面Fas结合后可诱导软骨细胞凋亡，并激活相关凋亡信号通路[16]。Ryu等[17]运用CD95抗体刺激小鼠软骨细胞凋亡呈现浓度依赖性，高浓度(0.5或1mg/mL)CD95抗体方可诱导软骨细胞凋亡，且缺氧诱导因子可加剧CD95抗体诱导软骨细胞凋亡的能力。

1.5 地塞米松 Tu等[18]利用地塞米松(25 μg/mL)刺激人软骨细胞凋亡，24 h后显示软骨细胞活性及增殖能力降低，流式细胞检查凋亡软骨细胞明显增多，且Fas调节的死亡信号通路是地塞米松诱导软骨细胞凋亡中重要的途径，实时荧光定量核酸扩增及细胞免疫荧光检测显示caspase-3及Fas含量明显升高。

1.6 前列腺素(prostaglandin，PG)E2PGE2是骨及软骨组织中维持细胞功能的重要调节因素，同时在正常关节软骨新陈代谢及OA疾病的发病机理中发挥重要的作用。相关研究表明，PGE2是关节生长板软骨细胞中DNA合成及硫酸盐渗入最有效的细胞因子，在OA关节滑膜组织中检测PGE2表达明显增高，可诱导软骨细胞凋亡改变[19]。Miwa等[20]报道利用PGE2体外刺激牛科软骨细胞，结果显示PGE2抑制软骨细胞活力，促使细胞DNA碎裂，进一步证实PGE2诱导凋亡机制并不是通过NO途径产生，而是通过激活软骨细胞环腺苷酸，从而提高细胞内的环腺苷酸水平来诱导软骨细胞凋亡。

1.7 双氧水(H2O2) 由于能诱导软骨细胞产生ROS，改变线粒体膜通透性，使细胞色素c从线粒体释放到胞质，H2O2常被用作软骨细胞凋亡的诱导剂。Na等[21]报道运用H2O2(500 μM/L)诱导鼠软骨细胞凋亡，出现软骨细胞活力降低，线粒体膜电位下降，软骨细胞蛋白Bcl-xL/Bax比例降低，caspase-3活性增加等软骨细胞凋亡表现。

1.8 重组腺病毒载体(recombinant adenovirus vectors，RAAV) RAAV是TNF家族中一种Ⅱ型跨膜蛋白，OA关节软骨中RAAV表达与软骨细胞凋亡比例及软骨退变程度相关。Lee等[22]首次报道运用RAAV体外刺激软骨细胞凋亡，检测软骨细胞活力及线粒体膜电位降低，使线粒体中细胞色素c释放，细胞核固缩及DNA碎裂，并激活DNA聚合酶活性，刺激caspase-3和Bax高表达及Bcl-2低表达，证实RAAV体外具有诱导软骨细胞凋亡的作用。

1.9 碱性磷酸钙晶体 碱性磷酸钙晶体由磷酸八钙、磷酸三钙、碳酸磷灰石及羟磷灰石组成。在重度OA关节软骨中发现碱性磷酸钙晶体在基质小囊中沉积，且与OA病情严重程度密切相关，碱性磷酸钙晶体可随着软骨退变或原位合成过程从软骨下骨中释放出来[23]。Ea等[24]报道运用碱性磷酸钙晶体体外诱导牛科软骨细胞凋亡，该过程与IL-1β、TNF-α及NO途径完全独立，需要与软骨细胞接触后形成内吞及溶酶体内晶体降解作用，且膜联蛋白-5过表达可以明显加剧碱性磷酸钙晶体促凋亡效能。

1.10 多氯联苯 多氯联苯为持久性有机污染物，广泛分布在室外空气、海水及河道的沉积物中，并在许多不同水平的食物链中被发现，其化学特性及毒性作用与其结构特性密切相关。相关研究表明多氯联苯可刺激关节软骨IL-6及TNF-α分泌，诱导软骨细胞凋亡及关节软骨退变，与OA疾病的发生、发展关系密切[25]。Abella等[26]报道运用多氯联苯体外诱导软骨细胞凋亡，结果显示软骨细胞活力明显降低，caspase-3蛋白表达增高及Bcl-2/Bax蛋白比例降低，通过脂质过氧化作用检测软骨细胞抗氧化能力降低，产生氧化应激反应，引起线粒体DNA损伤。Lee等[27]利用多氯联苯体外刺激兔关节软骨细胞，显示细胞活力随时间及剂量关系呈现不同程度的降低，检测细胞caspase-3表达升高，TUNEL染色及ELISA检测DNA碎裂显示凋亡比例明显增加，多氯联苯通过促进软骨细胞ROS及NO产生，诱导软骨细胞凋亡，加剧关节软骨退变。

1.11 晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs) AGEs是促进关节软骨退变及软骨细胞凋亡的重要递质，可与关节软骨胶原分子直接交联，导致关节僵硬及组织脆性增加，其在关节软骨中的异常表达被视为与年龄相关性最为密切的变化[28]。Yang等[29]报道体外运用AGEs(200 μg/mL)诱导兔软骨细胞凋亡，发现AGEs通过上调软骨细胞ROS，促进细胞色素c从线粒体释放到胞质，激活caspase-3活性，降低线粒体膜电位及抑制三磷酸腺苷产生，促进凋亡改变，可用于体外软骨细胞凋亡模型的构建。

1.12 阿霉素及衣霉素 阿霉素作为软骨细胞凋亡的诱导剂，主要通过激活caspase的活性，促进DNA碎裂引起，衣霉素则被视为ER激动剂诱导软骨细胞凋亡。Kumagai等[30]报道运用阿霉素体外刺激兔软骨细胞，其最显著的特征是可在数分钟内减少软骨细胞的横截面积，刺激凋亡软骨细胞体积减小，并伴有caspase-3及caspase-7活性增强，诱导软骨细胞凋亡。Lin等[31]运用衣霉素(2 μg/mL)诱导鼠软骨细胞凋亡，可降低细胞活力及线粒体膜电位，caspase-3、caspase-9、Bax蛋白及mRNA表达增加，衣霉素通过调节ER诱导软骨细胞凋亡。

2 软骨细胞凋亡介导的信号通路

2.1 胞内磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase，PI3K-Akt)信号通路 Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以被细胞外因子以PI3K依赖的方式磷酸化或激活。PI3K-Akt是一条经典的抗软骨细胞凋亡通路，当细胞外信号刺激PI3K-Akt发生磷酸化后，可促进软骨细胞中凋亡因子Bcl-2释放，抑制Bax活性，并有利于蛋白聚糖合成及软骨细胞成活，达到抗凋亡效能。因此，PI3K-Akt信号通路可有效地抑制由线粒体途径诱导的软骨细胞凋亡。Wang等[32]报道紫草素通过激活PI3K-Akt信号通路，降低caspase-3活性，抑制细胞色素c释放，达到抗IL-1β诱导的软骨细胞凋亡效果。Huang等[33]报道人参皂苷抗凋亡作用是通过活化PI3K-Akt信号通路，抑制软骨细胞caspase-3释放完成。Zheng等[9]报道通过激活PI3K-Akt信号通路，烟碱可中和由IL-1β诱导的软骨细胞凋亡作用。

2.2 P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路 P38 MAPK属于应力激酶家族成员，易被促炎细胞因子及渗透性改变、营养缺失、机械性负荷增加、低氧张力等环境因素激活。同时激活的P38可使转录因子磷酸化，从而转导信号进入原子核，改变基因表达。NO、IL-1β及TNF-α可诱导软骨细胞中P38 MAPK磷酸化，参与调节软骨细胞表型及增殖，促进软骨细胞肥大、钙化、骨架重塑及凋亡改变，刺激软骨细胞MMPs合成及炎性细胞因子产生，介导软骨细胞凋亡信号途径。Sakata等[34]报道通过抑制NO诱导的软骨细胞P38 MAPK磷酸化，下调MMP-3、MMP-13及caspase-3表达，十二碳五烯酸可抑制软骨细胞凋亡。Wei等[16]报道抑制P38 MAPK活化可作为OA潜在的治疗靶点，达到保持关节软骨细胞功能结构，抑制软骨细胞凋亡及促进增殖效能。

2.3 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路 JNK是分子量为54 kD、位于细胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称为应激活化蛋白激酶(Stress-activated kinases，SAPK)，是MAPK家族中重要成员之一。JNK信号通路可被细胞应激反应(如电离辐射、热休克及氧化损伤)、细胞因子(如NO、TNF-α、TGF-β及IL-1β)及生长因子(如表皮生长因子)激活而形成磷酸化JNK，参与细胞分化与增殖，维持细胞形态及骨架构建，并可直接激活胞质内靶蛋白(如Bax及Bim)，从而介导由线粒体途径引起的细胞凋亡。Sylvester等[35]研究表明IL-1通过激活JNK信号通路，一方面可上调MMP-13在关节软骨细胞中表达，导致关节退变及软骨细胞凋亡发生，另一方面可活化转录活化因子-2，促进环氧合酶(cyclooxygenase，COX)-2基因的转录，诱导软骨细胞炎症及凋亡。Lee等[15]报道JNK信号通路参与了TNF-α介导的软骨细胞凋亡，通过上调软骨细胞caspase-3及caspase-7活性，使磷酸化JNK表达增高，该过程可被JNK抑制剂逆转。

2.4 核因子(nuclear factor，NF)-κB信号通路 NF-κB是一类广泛存在于机体细胞中的多显性核转录因子，广泛参与调节细胞增殖与分化、细胞周期及细胞凋亡等过程，是Rel基因家族重要成员。在静息状态下，无活性的NF-κB以潜在状态分布于细胞浆中，它与抑制因子结合成为异源多聚体P50-P60-IκBα(IκBβ)。当细胞受到细胞因子等因素刺激时，IκBα从三聚体中游离出来，P50亚基上的易位信号及P56亚基上DNA结合位点被充分暴露，使异二聚物显示出NF-κB活性，并易位入细胞核，激活Bcl-2及p53等靶基因，参与构成细胞凋亡机制[36]。Qin等[37]报道IL-1β体外诱导的软骨细胞凋亡模型中，NF-κB被激活后可刺激软骨细胞中TNF-α、iNOS及COX-2产生，参与调节软骨细胞炎症及凋亡过程。Lee等[27]报道多氯联苯可通过刺激软骨细胞ROS及NO产生，激活NF-κB过程，从而诱导软骨细胞凋亡。

2.5 酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路 与众多细胞因子及生长因子信号转导有关的JAK/STAT通路，密切参与了细胞炎症、氧化应激、细胞增殖、分化及凋亡等病理过程。JAK/STAT信号转导过程概括为：细胞膜上的细胞因子受体在细胞膜上与相应配体结合后，诱导受体二聚化并调节与之偶联的JAKs，在胞质内的JAKs及其受体酪氨酸残基上依次发生交互磷酸化，并与周围氨基酸序列结合形成“停泊位点”，STATs通过SH2结构域将STAT蛋白补位到该特异位点，从而激活STAT。活化后的STAT与受体解离，形成同源二聚体或异源二聚体转位入细胞核，与DNA上特定靶序列结合，调控基因的转录及诱导表达[38]。Greene等[39]报道IL-1β联合抑瘤素作用于人关节软骨细胞，其诱导凋亡途径是通过激活JAK/STAT信号通路完成，并刺激软骨细胞MMP-13高表达。Lim等[40]利用IL-1β通过激活JAK/STAT信号通路诱导软骨细胞凋亡及MMP-13表达增高，该过程可被类黄酮药物作用逆转。

综上所述，多种细胞因子及信号转导通路共同参与软骨细胞凋亡的复杂病理过程，且各种细胞信号转导途径纵横交错、相互影响，构成了一个复杂的细胞凋亡信号转导通路网络，介导软骨细胞损伤及凋亡病变。众多的软骨细胞凋亡诱导因子通过信号转导通路传递刺激信号至效应细胞，诱导靶基因转录增加，导致软骨细胞凋亡及坏死发生，密切参与OA发生、发展过程。研究软骨细胞凋亡信号传导通路有助于更深入地探讨关节软骨发生退行性病变的分子机制，为OA防治研究提供了良好的思路及途径。

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1008-5572(2016)11-1010-05

R684.3

A

2016-03-15

周炎(1984- )，男，主治医师，武汉大学人民医院骨科，430060。

*本文通讯作者：刘世清