疏血通联合依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡及炎症水平影响研究

邢美荣　袁　红　张玉林　靳文勋　李茹茹

河北省保定市脑血管病医院(保定 071000)



疏血通联合依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡及炎症水平影响研究

邢美荣袁红△张玉林靳文勋李茹茹

河北省保定市脑血管病医院(保定 071000)

摘要目的：探讨疏血通联合依达拉奉对大鼠缺血性脑损伤的保护和作用机制，为二者联合应用于临床提供理论依据。方法：将100只大鼠，随机分成5组，每组20只。A组：单独疏血通治疗组；B组：单独依达拉奉治疗组；C组：疏血通联合依达拉奉治疗组；D组：阴性对照组(注射相同剂量生理盐水)；E组：假手术组(注射相同剂量生理盐水)。各组大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注手术缺血2 h后，进行静脉给药。后行神经行为学评分，脑组织中SOD活性和MDA含量的测定，ELISA法测定大脑组织IL-1β和TNF-α含量水平。结果：神经行为学评分可见E组与其他组评分有明显差异，评分很低；阴性对照组D组与3组治疗组对照差异也有明显性，评分较高；联合用药C组与A组、B组比较得分明显较低，差异有显著性。脑组织中SOD活性，GSH和MDA含量以及IL-1β、TNF-α的测定，可见C组患者情况明显好于A组、B组情况。结论：疏血通联合依达拉奉对防治脑缺血疾病具有更好的疗效。

主题词脑缺血@疏血通动物，实验大鼠

在缺血性脑血管的康复治疗中，恢复缺血区的血流供应是避免脑组织缺血损伤的首要条件，但与此同时带来的再灌注损伤也是目前医学研究的热点[1]。疏血通注射液主要用于治疗缺血性脑血管病患者，其主要成分为水蛭和地龙，具有活血化瘀、通经活络的作用，在临床治疗中取得了一定疗效。已经被日本的权威机构批准通过治疗中风患者的依达拉奉(Edaravone)是一种新型羟自由基清除剂，能够抑制脂质过氧化，防止神经元迟发性损伤。大量已发表的体内及体外研究表明疏血通联合依达拉奉对治疗缺血性脑血管疾病中的作用，对脑卒中、脑梗塞等具有良好的疗效。故本研究在整体动物水平和细胞水平的基础上建立大鼠脑缺血再灌注模型，探讨疏血通联合依达拉奉对大鼠缺血性脑损伤的保护和作用机制，为二者联合应用于临床提供理论依据。

1材料1.1局灶性脑缺血再灌注大鼠模型(MCAO)的制作先用10%水合氯醛(300 mg/kg)于大鼠腹腔注射将其麻醉，然后固定于鼠台，行颈正中切口，依次分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。在大鼠ECA近端备线，用无损伤动脉夹暂时夹闭其远端，CCA分叉处做一切口，插入4-0尼龙线，推进17～20 mm时可感阻力，表明栓线头端已经通过大脑中动脉(MCA)的起始处，阻断MCA部分血流来源。假手术组除不插线外，其余步骤同上。

1.2动物100只大鼠随机分成5组，每组20只。A组：单独疏血通治疗组；B组：单独依达拉奉治疗组；C组：疏血通联合依达拉奉治疗组；D组：阴性对照组(注射相同剂量生理盐水)；E组：假手术组(注射相同剂量生理盐水)。各组大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注手术缺血2 h后，进行静脉给药。

2实验方法2.1大鼠神经行为学评分大鼠局灶性脑缺血再灌注24 h后，观察存活大鼠的行为变化，参考Zea-longa的5分制评分标准进行评分，得分越高说明大鼠神经损伤导致的行为障碍越严重：行为正常，无神经功能损伤的为0分；对侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能损伤的为1分；行走时，向瘫痪侧不停转圈的为2分；行走时向对侧倾倒及不能站立为3分；不能行走，完全丧失意识的为4分；死亡的为5分。

2.2大鼠脑组织中SOD活性和MDA含量的测定缺血再灌注24 h后，大鼠断头处死，测SOD活性和MDA含量。SOD活力检测采用黄嘌呤氧化法，SOD活力以每毫克组织蛋白中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)表示，单位为U/mg prot；用硫代巴比妥酸显色法测定脑组织MDA含量，单位nmol/mg prot。严格按照试剂盒操作测定。

2.3大鼠脑部炎症因子检测拔线再灌注24 h后，各组大鼠立即断头，剥离大脑，提取组织总RNA，RT-PCR法检测IL-1β、TNF-α等相关炎症基因表达水平，ELISA法测定大脑组织IL-1β和TNF-α含量水平。

2.4统计学方法所有数据使用SPSS11.0软件分析，计量资料治疗前后比较采用配对t检验，计数资料采用χ2检验，均选取α=0.05为检验水准。

3结果3.1神经行为学评分可见假手术组E组与其他组评分有明显差异，评分很低；阴性对照组D组与3组治疗组对照差异也有明显性，评分较高；联合用药C组与A组、B组比较得分明显较低，差异有显著性。

3.2脑组织中SOD活性GSH和MDA含量以及IL-1β、TNF-α的测定，可见C组患者情况明显好于A组、B组情况。

4讨论缺血性脑损伤的复杂性和某些环节的尚不确定性都说明了药物神经保护的困难性，靶点单一的神经保护剂不能完全阻断复杂的缺血级联反应。因此，有学者提出鸡尾酒疗法，即作用于脑缺血级联不同环节的神经保护剂联合应用，例如自由基清除剂和谷氨酸拮抗剂的联合使用，联合用药的优点还在于减少药物的使用剂量和毒副作用[2]。

中药在脑缺血的预防和治疗方面有独特的作用，且越来越受到人们的重视。中药及一些复方制剂主要是通过活血化瘀、通经活络等方法多层次、多靶点、多环节的发挥作用，而脑缺血再灌注损伤的机制复杂[3-5]，也是多种因素共同作用的，二者相契合。目前临床上常用且有肯定疗效的主要有丹参、川芎、水蛭、葛根素、银杏制剂及一些复方制剂等[6]。疏血通注射液主要成分为水蛭和地龙，具有活血化瘀，通经活络等作用，临床上主要用于治疗脑梗死患者，且已取得了一定的疗效[7]。Meta分析结果显示，疏血通注射液治疗脑梗死在短期改善总有效率指标上优于对照组药物，能更好的降低身价功能缺损评分值，同时在改善血液流变学指标的程度上也强于对照组药物。另外在安全性方面，疏血通注射液不良反应较少，并且不良反应较为轻微，主要表现为过敏，一般不需要特殊处理[8]。

缺血性脑损伤的发生和发展是一个多种因素共同作用的病理过程，在缺血级联反应的每一过程中均存在可干预的途径。因此如何有效地阻断脑缺血的级联反应是目前神经保护剂治疗的研究重点[9-11]。依达拉奉作为自由基清除剂在临床治疗急性脑梗塞已具有很好的疗效，而上述研究已证实疏血通具有显著的抗免疫炎症、抗氧化作用和神经保护作用，提示我们疏血通联合依达拉奉对防治脑缺血疾病具有更好的疗效。

参考文献

[1] 中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010 [J].中国临床医生，2011,39(3)：67-73.

[2] Weng YC, Kriz J. Differential neuroprotective effects of a minocycline-based cocktail in transient and permanent focal cerebral ischemia [J]. Exp Neurol, 2007, 204(1): 433-442.

[3] Hou YC, Liou KT, Chern CM, et al. Preventive effect of silymarin in cerebral ischemia-reperfusion-induced brain injury in rats possibly through impairing NF-κB and STAT-1 activation [J]. Phytomedicine, 2010, 17(12): 963-973.

[4] Jie Pan, Angelos-Aristeidis Konstas, Brian Bateman, et al. Reperfusion injury following cerebral ischemia: pathophysiology, MR imaging, and potential therapies [J]. Neuroradiology, 2007, 49: 93-102.

[5] 刘启锋，刘明，刘玉河.脑缺血再灌注损伤机制研究进展[J].中华神经外科疾病研究杂志，2006,5(6): 566-568.

[6] Prabhu S, Narayan S, Devi CS. Mechanism of protective action of mangiferin on suppression of inflammatory response and lysosomal instability in rat model of myocardial infarction [J]. Phytother Res, 2009, 23(6): 756-760.

[7] 张璇，余震，胡长林.水蛭地龙提取液治疗急性脑梗死的作用机制及疗效[J].中国脑血管病杂志，2005,2(6): 244.

[8] 方萍，童小文，朱虹.疏血通注射液治疗急性脑梗死的疗效观察[J].上海医药，2008, 29(3)：126-128.

[9] 李蕾，许栋明，王文，等.脑缺血再灌注后脑血屏障损伤机制及药物保护作用的研究进展[J]. 中国康复理论与实践，2009,15(10): 901-904.

[10] Wu TC, Grotta JC. Stroke treatment and prevention: five new things [J]. Neurology, 2010, 75(18 Suppl 1): S16-21.

[11] Turner RC, Lucke-Wold B, Lucke-Wold N, et al. Neuroprotection for ischemic stroke: moving past shortcomings and identifying promising directions [J]. Neurology, 2013, 17(14): 1890-1917.

(收稿2016-01-28；修回2016-03-05)

【中图分类号】R722.15

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.053

△河北大学附属医院病案室(保定 071000)