双丹口服液的HPLC指纹图谱研究*

李　骅　高　雅　杨　倩　谢艳华　张邦乐　毕琳琳　靳雨晨　张晓良　王四旺

第四军医大学(西安710032)



双丹口服液的HPLC指纹图谱研究*

李骅高雅杨倩谢艳华张邦乐毕琳琳靳雨晨张晓良王四旺△

第四军医大学(西安710032)

摘要目的：建立双丹口服液冻干粉的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为该药的质量控制提供依据。方法：色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm，Agilent)，柱温30 °C，流动相为甲醇与2%冰醋酸。采用梯度洗脱程序：甲醇-2%冰醋酸(5∶95，v/v)0 min，(5∶95)10 min，(25∶75)30 min，(40∶60)50 min，(60∶40)70 min，流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长280 nm；以建立的HPLC分析方法对双丹冻干粉进行指纹图谱分析表征，确认各物质成分归属。结果：双丹冻干粉指纹图谱中有11个共有特征峰，其中1、6和11号峰分别为源自牡丹皮的没食子酸、芍药苷和丹皮酚，2、3、4、5、7、8、9和10号峰分别为源自丹参的丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。结论：本次研究为后续双丹各制剂的整体质量描述和评价及双丹冻干粉给药后血中移行成分的分析奠定了基础，也为进一步探讨双丹方的物质基础及作用机制提供了依据。

主题词色谱法@双丹口服液

中药复方所含化学成分复杂，复方药效的发挥是其所含多种化学成分的整体表现。此外，中药配伍成复方后，其原生化合物种类增多，对加工处理(如煎煮、渗滤)的反应性增强，极易引起处方中各原生化合物间的化学反应，生成新的体外次代谢生产物[1]。因此，寻找一种能够全面准确的反映复方整体化学成分信息的质控手段也正是中药复方科学化、现代化所面临的难点之一。中药指纹图谱技术是目前国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段，它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类与数量，进而为中药复方物质基础研究提供科学、合理的依据[2- 3]。

丹参、牡丹皮药对，收载于《施今墨对药临床经验集》，是中国近代著名中医临床家施今墨先生临床辨证施治的经验方剂，亦名双丹方。方中丹参味苦微寒，能通行血中之滞，凉散血中之热，清心阴安心神，祛瘀而生新；牡丹皮辛苦而寒，功善凉血活血，能行瘀血，安络血，入血分清热化滞，清透阴分伏邪；二药相须配伍，同气相求，共奏凉血活血，清透邪热之功，属于非常经典的清热活血组合[4]。其口服液剂型被收载于2005、2010和2015年版的《中国药典》(一部)，具有活血化瘀、通脉止痛的功效，用于瘀血痹阻所致的胸痹，症见胸闷、心痛，在部分地区应用量大[5]。双丹口服液主要有效成分为酚酸类成分，药典中仅以丹参素的含量作为质量控制指标，虽然此方法简单易行，但并未纳入源自牡丹皮的化学成分以及丹参中的其他化学成分，尚不能全面控制双丹口服液的整体质量[6-9]。此外，与多数中药复方一样，双丹方所含化学成分复杂，药效物质基础尚不明确，一定程度上限制了其国际化推广。本课题按照文献制备工艺[5]，利用HPLC-UV技术建立双丹口服液冻干粉(简称双丹冻干粉)指纹图谱，为后续双丹相关制剂的整体质量控制和评价奠定基础，为进一步探讨双丹方的物质基础及作用机制提供依据。

1仪器与试药 1.1仪器Shimadzu LC-2010A HT型高效液相色谱系统(岛津制作所，日本)； Sartorius ME235S型微量分析天平(赛多利斯仪器系统集团公司，德国)；Eppendorf Certrifuge 5417R型台式高速冷冻离心机(艾本德生命科技集团公司，德国)；Milli-Q Academic超纯水系统(Merck Millipore集团公司，德国)； SK2510LHC型双频加热型超声波清洗器。

1.2试药双丹冻干粉(第四军医大学药物研究所提供，10批，编号为B1～B10)；没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110831-200803)；丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110855-201210)；原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110810-201007)；原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110809-201205)；咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110736-201136)；紫草酸对照品(宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20130827)；迷迭香酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111871-201203)；丹酚酸A对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-13020701)；丹酚酸B对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-13103113)；丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110708-200506)；甲醇(色谱纯，美国霍尼韦尔国际集团公司)；冰醋酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)。

2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱：ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm，Agilent)，柱温：30 °C；流动相为甲醇与2%冰醋酸，采用梯度洗脱法，时间程序为：甲醇-2%冰醋酸(5∶95，v/v)0min，(5∶95，v/v)10min，(25∶75，v/v)30 min，(40∶60，v/v)50 min，(60∶40，v/v)70 min，流速1 mL/min(洗脱程序详见表1)；进样量：20 μL，检测波长：280 nm。

2.2溶液的制备供试品溶液制备：将双丹冻干粉粉末研细，精密称取1.0 g于50 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，称重并于室温下静置15 min，超声清洗仪震荡30 min，冷却至室温后称重，以50%甲醇补足前后两次称重质量差，涡旋振荡20 s，静置后将上层澄清液于12000 r/min高速离心15 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。以同样方法分别制备缺牡丹皮、缺丹参阴性样品溶液。

对照品溶液制备：精密称取没食子酸、丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、芍药苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B及丹皮酚对照品适量于25 mL棕色容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容至刻度，配制成对照品混合溶液母液。

2.3方法学考察2.3.1精密度实验:取批号为B4的双丹冻干粉，制得供试品溶液，以拟定的色谱条件进行HPLC检测。结果表明，样品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.49%，RPA的RSD均小于1.67%，表明仪器精密度良好，符合相关技术标准[10]。

2.3.2重复性实验:取批号为B4的双丹冻干粉，制得供试品溶液，共6份，以拟定的色谱条件进行HPLC检测，记录各色谱峰的RPA和RRT，计算RSD值。结果显示，样品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.46%，RPA的RSD均小于2.53%，表明当前测定方法具有较好的可重复性，符合相关技术标准[10]。

2.3.3稳定性实验:取批号为B4的双丹冻干粉，制得供试品溶液，室温放置，分别于0、120、240、480、720和1440 min以拟定的色谱条件进行HPLC检测，记录各色谱峰的RPA和RRT，计算RSD值。结果显示，样品溶液(B4)中各共有峰RRT的RSD均小于0.47%，RPA的RSD均小于1.77%，表明样品溶液(B4)在1440 min内基本稳定，符合相关技术标准[10]。

2.4测定及分析2.4.1指纹图谱测定:10批双丹冻干粉样品按拟定(2.2项)方法分别制得供试品溶液，拟定(2.1项)色谱条件进行HPLC检测，记录各供试品溶液所得图谱。结果如图1所示。

2.4.2共有峰的标定:由色谱工作站辅助自动进行峰匹配，确定11个共有峰(CP)。参照峰的选取原则以共有峰中峰面积较大、出峰时间较稳定为标准，以指定参照峰的峰面积以及出峰时间为基准，其他各共有峰的峰面积及出峰时间分别与其相比，通过分析运算得出10批双丹冻干粉指纹图谱中各共有峰的RPA和RRT。11号色谱峰符合参照峰条件，经标准品比对认定为丹皮酚的吸收峰，以其为参照峰，图谱中共有峰的RRT和RPA计算结果见表2及表3。

2.4.3相似度评价:以所得图谱中各CP峰面积的中位数为基准，分别通过“夹角余弦法(IAC)”以及“相关系数法(CC)”两种方法评价10个批次双丹冻干粉指纹图谱的整体相似度[11]。结果表明，两种相似度评价方法所得样品相似度均在0.99以上。

2.4.4指纹图谱共有峰的归属:取批号为B4的双丹冻干粉、缺丹参冻干粉供试品溶液、缺牡丹皮冻干粉供试品溶液及对照品溶液，以拟定的色谱方法进样检测，分别对照各样品所得液相色谱图，确定CP及其归属。如图所示，经过对比双丹冻干粉、缺牡丹皮阴性样品、缺丹参阴性样品色谱图。

a：标准品；b：双丹冻干粉(B4)；c：缺牡丹皮阴性样品；d：缺丹参阴性样品；1. 没食子酸，2. 丹参素，3. 原儿茶酸，4. 原儿茶醛，5. 咖啡酸，6. 芍药苷，7. 紫草酸，8. 迷迭香酸，9. 丹酚酸B，10. 丹酚酸A，11. 丹皮酚

图2双丹供试品及标准品色谱图

双丹冻干粉指纹图谱的11个共有峰中，1、6、11号峰来源自牡丹皮，2、3、4、5、7、8、9、10号峰均来源自丹参。通过标准品UV光谱与保留时间对色谱峰进行定性认定，确定1、6、11号峰分别为没食子酸、芍药苷和丹皮酚，2、3、4、5、7、8、9和10号峰分别为丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A。

3讨论多成分、多靶点、多通路整合式“霰弹”作用，是中药复方治疗疾病的主要特点之一。与多数中药复方一样，双丹方系列制剂临床疗明确，但因化学组成成分不清，体内作用的药效物质基础及作用机制尚未阐明，无法为临床疗效提供进一步详实的科学依据，一定程度上限制了其科学应用及国际推广。中药复方指纹图谱是中药成分信息的化学表征，也是目前国际认可的能够较全面的反映中成药、天然药物所含化学成分信息的有效方法[12-13]。中药复方指纹图谱技术能够将预处理后的中药复方复杂体系通过直观的色谱、质谱及光谱(或其联用图谱)加以反映，基于图谱中化学成分的表征，后续还可开展一系列与复方相关的药动、药效学研究。因此，建立双丹方的指纹图谱对于双丹系列制剂的质量控制和物质基础研究都具有重要意义。

预实验中曾利用沃特世色谱仪配备的2996型二极管阵列检测器对双丹冻干粉供试品和相关混合标准品溶液进行全波长扫描(210～400 nm)，发现在280 nm各被检物质均有较强UV吸收峰，且背景噪音信号较小，对各被检物质峰无干扰，因此选定280 nm作为检测波长。双丹冻干粉中多种成分遇热不稳定且在高浓度醇溶液中不稳定[14-15]，故采用超声提取法，选用25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇为溶剂，考察溶剂对提取效果以及被检物质色谱信息的影响。最终确定以50%甲醇为溶剂，超声处理(频率：53 Khz，时间：30 min)作为样品提取方法。双丹制剂中多种水溶性成分由于含有酚羟基而使自身在溶液中呈弱酸性，洗脱过程中会出现色谱峰拖尾情况，因此考虑在洗脱溶剂中加入适量酸以抑制酚羟基上H+的电离，以改善谱图峰型。考察了甲醇-水、甲醇-2%冰醋酸、甲醇-0.5%磷酸等不同流动相体系，以及等度洗脱和梯度洗脱等不同的洗脱程序，测定显示采用甲醇-2%冰醋酸梯度洗脱所得各样品峰形好，干扰成分少，保留时间合适，故选此洗脱系统作为流动相。根据所选流动相，色谱柱应耐酸并能承受较大水相，试验中曾试用Agilent ZORBAX SB C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱、Ultimate XB C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱、Yilite SinoChrom ODS-BP C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱，对比发现经安捷伦ZORBAX SB C18色谱柱分离后的谱图信息全面，各被测物质峰均能达到良好分离，故最终确定选用此色谱柱。

本研究首次建立了双丹冻干粉的HPLC-UV指纹图谱，明确了其所含的11种主要物质成分，分别为来源于牡丹皮的没食子酸、芍药苷和丹皮酚，来源于丹参的丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B及丹酚酸A。该结果使得双丹方(制剂)中众多尚不明了的物质成分得到明晰，各物质成分的归属也由无序发展为有序。双丹指纹图谱分析方法的建立，为后续双丹各制剂的整体质量描述和评价及双丹冻干粉给药后血中移行成分的分析奠定了基础。也为进一步探讨双丹方的物质基础及作用机制提供了依据。

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(收稿2016-02-23；修回2016-03-05)

HPLC fingerprint study of Shuangdan oral liquid

The Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Li HuaGao YaYang Qianet al

KEY WORDSChromatography@Shuangdan oral liquid

ABSTRACTObjective: To establish the HPLC fingerprints for the quality control of Shuangdan oral liquid and provide information on the therapeutic material bases of Shuangdan prescription. Methods: Separation was performed at 30 °C on ZORBAX SB C18 (250 mm×4.6 mm 5 μm, Agilent) with a mobile phase gradient (flow rate: 1 mL·min-1) prepared from methanol and 2% aqueous glacial acetic acid (v/v). The detection wavelength was 280 nm. The method was applied for the identification of major components in chemical fingerprint of SD lyophilized powder. Results: 11 main peaks exist in ten sample profiles were selected as the common peaks. The 11 compounds were simultaneously identified by UV spectrum and relative retention time compared with the reference standards. They are gallic acid, paeoniflorin and paeonol from Cortex Moutan and danshensu, protocatechuic acid, protocatechuic aldehyde, caffeic acid, lithospermic acid, rosmarinic acid, salvianolic acid B and salvianolic acid A from Radix Salvia Miltiorrhizae. Conclusion: This method could provide reference standard for the quality control of Shuangdan oral liquid and its related preparations, and could also provide more informations on the therapeutic material bases of Shuangdan prescription.

通讯作者△

【中图分类号】R282

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.043

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2012K19-03-02；2013K12-07-05)