超高压对微生物的影响

路志芳　陈现臣　周民生

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳455000）



超高压对微生物的影响

路志芳陈现臣周民生

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳455000）

摘要：超高压杀菌是1个十分复杂的过程，其杀菌效果受多重因素影响。如革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌的耐压性强；水分降低，微生物的耐压性增加；pH值降低时，微生物的杀灭效果增强；蛋白质、碳水化合物和脂类有一定的抗压性；在一定范围内，压力越高，杀菌效果越好；而在相同压力下，增加处理时间杀菌效果也在一定程度上得到提高；在一定温度下，微生物中的蛋白质、酶等物质会发生一定程度的变性。通过杀菌动力学，可以描述微生物的致死特性和规律，对预测微生物的数量和保证食品微生物安全有重要的作用。

关键词：超高压；微生物；灭菌

超高压通过破坏细胞膜、核糖体等细胞的外部与内部结构以及细胞内重要蛋白质，使细胞的物质代谢和能量代谢失去平衡，从而导致微生物死亡[1]。

1　灭活机理

超高压通过影响细胞膜的形态、微生物的生化反应，从而灭活微生物。被普遍认可的观点是，膜在压力作用下受到损伤，胞内组分外泄，从而导致细胞死亡。但所用的压力不足以诱导细胞完全渗漏，渗漏仅限于外膜，如革兰氏阴性菌，压力释放后，渗漏的膜就会迅速修复，此结果在Ritz[2]等进行的沙门氏菌膜蛋白研究中得到证实。Ritz等观察到，超高压处理后，大部分外膜蛋白消失，而质膜蛋白仍然保留。高压下微生物细胞膜的流动性发挥重要作用，流动性增强的膜可避免压力伤害细胞。

被看作另一个重要的压力杀死细胞的原因是压力作用导致微生物中关键酶变性。胞内酶似乎不是压力抵抗性的决定因素，而ATP酶才是关键酶。

此外，HPP处理中的氧化胁迫似乎起着重要作用。厌氧条件下，随着恢复活细胞的增加，编码氧化应激的调节元件（如oxyR和SOXS）的基因和编码HPII氢过氧化物酶（katE）与过氧化物歧化酶（sodAB）的基因发生突变的大肠杆菌菌株的压力敏感性增加，HPP引发铁从Fe-S簇释放，而铁释放会通过Fenton反应产生游离羟基自由基。

细菌孢子具有较强的抗压性，其灭活机理有别于营养体。中温和脉冲压力条件下，压力先诱导孢子发芽，然后杀死发芽的孢子。从生化角度分析，发芽体结合到受体加速发芽并伴随Ca2+与别的离子的流出和水流入孢子内，使得孢子特定外皮裂解酶活化。因发芽期孢子组分不断溶解，系统体积下降，压力可增强发芽。根据Le Chatelier’s原理，任何导致活化体积减小的反应都会在高压作用下加速。这也意味着高压诱导的发芽与生理途径的活化有关，因此高压不仅仅是水被压进孢子原生质体的理化过程，抑制营养诱导发芽的物质也抑制压力诱导型发芽。

2　影响超高压杀菌效果的因素

2.1与微生物有关的变量

此类变量包括微生物的种类和数量及细胞的状态。一般而言，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌具有更强的耐压性。病毒结构多种多样，对压力抗性变化较大。酵母对压力敏感，霉菌营养体相对敏感，而囊孢子非常耐压。通常营养体能够在400～600MPa压力下被灭活，而一些孢子在室温下能够耐受1000MPa以上的压力。

2.2与产品有关的变量

2.2.1水分活度（Aw）

一般认为，随着Aw的降低，微生物的耐压性增加，细胞质表现为不可压缩性，蛋白质的稳定性得到增强。345MPa、21℃保压5min，当Aw>0.98时，拜耳结合酵母完全失活；当Aw为0.92、0.91和0.90时，酵母数量减少量的对数值为1。在不同Aw下，超高压（600 MPa）300s对李斯特菌冻干细胞的影响试验结果显示，当配制李斯特菌冻干细胞悬浮液的蛋白胨水浓度减少至60％（Aw0.8）时，细菌存活率明显增加。

2.2.2pH值

每种微生物都有适应其生长的pH值范围，不同pH值条件下，微生物的耐压性均有所不同。已发现酸性比中性压力对细胞的破坏更大。蒸馏水中的细胞比缓冲液中的细胞对压力更敏感。据报道，压力会改变介质的pH值，并逐渐缩小微生物生长的pH值范围。在低pH值下，芽孢对压力更敏感，明显失活。Alpas等人[3]研究了8种微生物在不同pH环境下超高压处理效果，结果证明，当pH降低时，微生物的杀灭效果得到增强。比如大肠杆菌0157：H7933在25℃、345MPa下处理5min，当环境pH为6.5时可杀灭1.86个对数值；当pH值降低至4.5时，灭菌效果增强了两倍多。此外，高压造成的损伤微生物可在营养丰富环境中复活，却不能在酸性条件下修复。

2.2.3产品组成

蛋白质、碳水化合物和脂类在压力传递的过程中具有一定的抗压性，因此它们对微生物具有保护作用。一般来说，盐的浓度越高，细菌对超高压的耐性越大。

2.2.4过程变量

主要包括压力大小、保压时间、温度、使用的脉冲。在一定范围内，压力越高，杀菌效果越好；而在相同压力下，增加处理时间，杀菌效果也在一定程度上得到提高。对牛奶中大肠杆菌的耐压性进行试验，结果表明，处理时间越长，压力越大，大肠杆菌存活数越少。处理压力（100～600MPa）和保压时间对鲜榨苹果汁和胡萝卜汁中的菌落总数的降低均有显著影响，但在低压下，时间对杀菌效果影响不大。

在一定温度下，微生物中的蛋白质、酶等物质会发生一定程度的变性。一些学者证明，当在15～30℃室温下采用超高压处理时，微生物有最大的抗性，因而，高于或低于室温的处理倾向增加杀灭效果。Alpas等人[3]研究8种微生物对高压结合中温处理后发现，在温度从25℃升到50℃后，8种微生物的死亡率都显著提高。如金黄色葡萄球菌485在345MPa、25℃下处理5min，只能杀灭1个对数值；而当温度升至50℃时，灭菌效果增强了5倍。曾庆梅等[4]发现，在压力为450MPa、保压时间为10min的条件下，协同温度≥29℃时，梨汁中菌落总数为70CFU/ mL，大肠菌群、霉菌和酵母菌未被检出，完全达到国家食品卫生标准。Koseki等[5]对牛奶进行中温协同灭菌（李斯特菌），在550MPa压力下，将温度从37℃提高到50℃，保压时间可以从4h减少为10min。Ailine[6]等人研究了前后施加热处理对超高压处理黑曲霉的效果的影响，结果显示，在高压前施加热处理只有叠加作用，并没有协同作用。而先超高压处理，后进行热处理时，就表现出了协同作用。除金黄色葡萄球菌（增加不明显）、枯草芽孢杆菌、生芽孢梭状杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌外，大多数微生物在-20℃条件下的高压杀菌效果要比20℃条件下好。超高压处理（100～500MPa）羊奶时，4℃条件下比常温（25℃）条件下，杀灭荧光假单胞菌、无害李斯特（氏）菌和瑞士乳杆菌的效果要好，而大肠杆菌和金黄色葡萄球菌恰好相反。

加压可以是静态或动态，不同模式的效果直接相关于压力大小和保压时间。动态加压可以是脉冲或循环式，而后者是脉冲和静态的结合。脉冲加压灭菌效果显著。

此外，加压泄压的速度也影响超高压杀菌的效果。60℃和70℃条件下缓慢加压结合缓慢泄压对枯草芽孢杆菌孢子的破坏力大于快速加压和快速泄压。但快速加压和缓慢泄压时，致伤细胞的数量会更大。

3　杀灭动力学

通过杀菌动力学可以描述微生物的致死特性和规律，对预测微生物的数量和保证食品微生物安全有重要的作用。有几种方式用来报道灭菌效果，普遍被认可的是在恒温下加热菌悬液时，活菌数的下降可用一级反应方程描述：-dN/dt=k·N，N为活菌数，k为灭菌反应中的一级速率常数。在开始时刻，N=N0，方程就可变成：Ln（N/N0）=-kt，则D值（降低活菌数90％所需的时间）可定义为：D=-t/log（N/N0）。一级灭活速率常数k和D值是解释热处理灭菌原因中常用到的概念。对应于热灭活中的D值，高压处理中的90％致死所需时间（Dp值）可被定义。在这种情况下，时间表示恒压下的处理时间。采用一级动力学模型来分析超高压杀菌效果，是基于所有微生物菌群同时暴露于压力下，并且具有相同的致死时间的假设。事实上，不同微生物菌群的致死时间不同，纯菌亦因生物的多样性，其不同细胞的致死时间不同。因而，在半对数坐标中灭活曲线也可能是非线性的，典型的是肩部和（或）拖尾。描述具有非线性杀灭特点的模型有biphasic，n级动力学、修订Gompertz、Baranyi、log-logistic、Weibull等。概率论模型Weibull假定死亡率为可能性结果，且破坏曲线表示的是死亡事件的累积分布。在Weibull模型中，级差因子b和形状因子分别描述杀灭效果和曲线凹凸程度。此几类模型也可用于预测各种压力温度组合的杀菌效果，并为不牺牲微生物安全性条件下选择最佳处理参数提供灵活性。

一组动力学参数获得后，动力学参数的压力灵敏性就可以评估。超高压中微生物或酶的灭活的线性动力学可用Arrhenius类模型或压力死亡时间模型进行分析。压力杀灭模型分析中的动力学参数压力依赖性可通过Dp的十进制对数对压力作图来确定。从log（Dp）对压力的回归斜率可以确定压力Z值（Zp）为斜率的负倒数：Zp=-（l/slope），因此Zp值代表导致Dp值10倍改变的压力变化值。在Arrhenius模型中，k值的压力依赖性被作为活化体积变化从ln（k）对压力的回归斜率算得，见方程：ΔV#=-RT（slope）or -T[Δ（1nk）/ΔP]，P为压力（MPa），k为速率常数（min-1），T为绝对温度（K），R为气体常数，ΔV#为活化的条件变化（m3mole-l）。

模型拟合度的优劣由精确因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）、根均方差（Rootmean square error，RMSE）相关系数（Correlation coefficient，R2）4个参数来评判。参数Af和Bf用于衡量模型的有效性，Af值表示预测值与实测值偏离的程度。Af值越小表明模型预测值与实测值越接近，模型越精确。当Bf>1，表示模型预测值比实测值高；当Bf<1，表示模型预测值比实测值低。因此，当Bf越接近1，模型拟合度越高。相关系数R2和RMSE表示模型的精确度、可靠度，R2越接近于1，RMSE越小，模型拟合度越高。

Lim[7]发现超高压处理的辣椒酱（Kochujang），其活菌数为1.56×103CFU/g，明显低于热处理样品（1.43×106CFU/g）和未处理样品（3.78×106CFU/g）。37℃贮藏120d后，热处理的样品中活菌数降到3.10×10 CFU/g，而超高压处理的样品贮藏到90d时，就检测不到活菌。滴定酸含量，高压处理样品低于未处理样品，而高于热处理样品。还原糖和乙醇含量三者没有明显差异。此外，处理样品的Hunter L、a和b值下降速度明显低于未处理样品。这说明超高压可以有效地抑制辣椒酱中的微生物，并能保持原有营养成分和品质。超高压的杀菌效果随黄豆酱（Doenjang）中盐浓度增加而下降，压力敏感性下降的次序依次为霉菌、酵母和细菌。650MPa下处理40min可以杀灭黄豆酱中的大部分酵母和霉菌。高压作用于生物分子和微生物的效果不同于热处理，并且会因食品体系的不同有所差异。

参考文献

[1] Huang HW，Lung HM，Yang BB，et al.Responses ofmi⁃croorganisms to high hydrostatic pressure processing[J].Food Control，2014，40∶250～259.

[2] Ritz M，Freulet M，Orange N and Federighi M.Effects of high hydrostatic pressure onmembrane proteins of Salmonella typhimurium[J].International Journal of Food Microbiology，2000，55∶115～119.

[3] Alpas H，Kalchayanand N，Bozoglu F and Ray B.Inter⁃actions of high hydrostatie pressure，pressurization temperature and pH ondeath and injury of pressure～resistant and pres⁃sure～sensitive strains of foodborne pathogens[J].International Journal of Food Microbiology，2000，60∶33～42.

[4]曾庆梅，潘见，谢慧明，等.中温协同超高压处理对梨汁中微生物的影响[J].食品科学，2004，25（8）：30～34.

[5] Koseki S，Mizuno Y，Yamamoto K.Use ofmild～heat treatment following high～pressure processing to prevent recov⁃ery of pressure～injured Listeriamonocytogenes inmilk [J].Food Microbiology，2008，25（2）：288～293.

[6] Alline A L Tribst，Mark A Franehi，Marcelo Cristianini and Pilar Rde Massaguer.Inactivation of Aspergillus niger inmango nectar by high～pressure homogenization combined with heat shock [J].Food Microbiology and Safety，2009，74（9）：509～514.

[7] Lim S，Kim B-O，Mok C，Park Y-S.Quality changes⁃during storage ofgochujang treated with heat and high hydrostat⁃ic pressure[J].Journal of Korean Society of Food Science and Nu⁃trition，2001，30（4）：611～616.