大孔吸附树脂纯化富集五脉绿绒蒿总生物碱

孙政华， 郭 玫*， 邵 晶， 王志旺

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2.甘肃省高校中［藏］药化学与质量研究重点实验室，甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃中医药大学，甘肃兰州730000）



大孔吸附树脂纯化富集五脉绿绒蒿总生物碱

孙政华1，2， 郭 玫1，2*， 邵 晶1，3*， 王志旺1，3

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；2.甘肃省高校中［藏］药化学与质量研究重点实验室，甘肃中医药大学，甘肃兰州730000；3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃中医药大学，甘肃兰州730000）

摘要：目的 优化大孔吸附树脂纯化富集藏药五脉绿绒蒿Meconopsis integrifolia中总生物碱的工艺。方法 以盐酸罂粟碱为对照品，采用紫外分光光度法测定总生物碱含有量；以吸附率及解吸率等为指标，考察不同型号树脂；考察静态吸附-解吸附动力学曲线，确定吸附和解吸时间。然后，筛选解吸剂体积分数、上样液质量浓度、流量等相关参数。结果 AB-8型树脂对五脉绿绒蒿总生物碱的吸附解吸性能最好，比吸附量44.15 μg/g、吸附率86.74％，解吸率91.39％，静态吸附和解吸时间分别为8 h和10 h。结论 经AB-8大孔树脂纯化富集后，所得干浸膏中五脉绿绒蒿总生物碱纯度提高了2.39倍，回收率为79.88％，而且干浸膏黏度和吸湿性均降低。

关键词：五脉绿绒蒿；总生物碱；大孔吸附树脂

邵 晶，女，副教授，从事中药和中药制剂有效部位及质量标准研究。Te1：（0931）8765394，E-mai1：cn221@163.com

Purification technology for total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel by macroporous resin

SUN Zheng-hua1，2， GUO Mei1，2*， SHAO Jing1，3*， WANG Zhi-wang1，3
（1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 73OOOO，China；2.Gansu Provincial High Educational Key Laboratory for Chemistry and Quality of Traditional ChineseMedicine，Gansu University of ChineseMedicine，Lanzhou 73OOOO，China；3.Gansu Provincial Key Laboratory for Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 73OOOO，China）

KEY WORDS：Meconopsis quintuplinervia Rege1；tota1a1ka1oids；macroporous resin

绿绒蒿收载于《中华人民共和国卫生部药品标准.藏药》第一册，为常用藏药，是罂粟科绿绒蒿属植物，主要分布于西藏、青海、甘肃等地，基源复杂，其中五脉绿绒蒿Meconopsis quintuplinervia Rege1、全缘绿绒蒿Meconopsis integrifolia（Maxim.）Franch和红花绿绒蒿Meconopsis punicea Maxim均系其主流品种。其味甘、涩，性凉，具有清热、消炎、止痛、镇咳、平喘、利尿等功效，藏医主要用其治疗肝炎、肺炎、胆囊炎、肺结核、胃溃疡等疾病，并且该植物消炎止痛的功效在临床尤为突出［1-2］。本实验以纯化富集五脉绿绒蒿总生物碱为目标，筛选了大孔树脂型号及纯化工艺参数，确定最佳工艺条件，为进一步研究藏药绿绒蒿总生物碱抗炎镇痛作用机理及其提取物的制备提供了科学方法，为相关新药的开发提供工作基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器与设备 BS-124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；UV-3300紫外-可见分光光度计、石英比色皿（上海美谱达仪器有限公司）；小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）。

1.2 实验药物与试剂 五脉绿绒蒿采自甘肃甘南，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为罂粟科植物绿绒蒿Meconopsis integrifolia（Maxim.）Franch的干燥全草。罂粟碱对照品（中国食品药品检定研究院，编号171214-200404）。NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-100树脂（天津市海光化工有限公司）。实验用水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 五脉绿绒蒿总生物碱含有量测定方法的建立［3-4］

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取罂粟碱对照品15.4 mg，0.01 mo1/L盐酸溶液溶解并定容至250 mL量瓶中，即得61.6 μg/mL盐酸罂粟碱对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取五脉绿绒蒿粗粉2.0 g，置于250 mL锥形瓶中，加10 mL氨水充分搅拌，静置30 min，加95％乙醇60 mL，超声提取40 min，放冷，抽滤，滤液转移至蒸发皿中，水浴挥干溶剂，加0.01 mo1/L盐酸5 mL使其完全溶解，过滤，即得。

2.1.3 测定波长选择 扫描盐酸罂粟碱对照品溶液和纯化后绿绒蒿总生物碱的紫外光谱图，并结合文献，确定以其最大吸收波长416 nm为检测波长。2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取盐酸罂粟碱对照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于分液漏斗中，加醋酸盐缓冲液5.0 mL、溴甲酚绿2.0 mL摇匀，再加氯仿16 mL充分振摇，静置，分取氯仿层，在416 nm处测定其吸光度，再以0.01 mo1/L盐酸同法作空白对照。以罂粟碱浓度（x）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘图，结果在3.85～23.10 μg/mL范围内，两者呈良好的线性关系，回归方程A=0.032 3x+0.026 3，r= 0.998 5。

2.1.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液0.5 mL，按“2.1.4”项下方法测定吸光度，连续测定5次。结果，平均值为0.428，RSD为0.33％，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液0.5 mL，按“2.1.4”项下方法分别于0、2、4、6、20 h测定吸光度。结果，RSD为1.95％，表明样品溶液在20 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取5份样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，“2.1.4”项下方法测定吸光度。结果，RSD为2.30％，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称定含有量已知的样品1 g，共6份，分别加入盐酸罂粟碱对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，“2.1.4”项下方法测定吸光度。结果，平均回收率为97.49％，RSD为2.25％，表明加样回收率良好。

2.1.9 样品中总生物碱含有量的测定 精密吸取样品溶液1.0 mL，于蒸发皿中水浴挥干溶剂，加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定吸光度，代入回归方程，计算总生物碱含有量，得五脉绿绒蒿粗提液中总生物碱的质量浓度为10.18 μg/mL。

2.2 大孔吸附树脂纯化五脉绿绒蒿总生物碱的工艺研究

2.2.1 五脉绿绒蒿粗总生物碱溶液的制备［3-4］称取五脉绿绒蒿粗粉200 g，95％乙醇回流提取2次（第1次1 000 mL，浸渍12 h，回流1.5 h；第2次800 mL，回流1 h），滤过，合并滤液，减压回收溶剂，转移至蒸发皿，蒸干至无醇味。残留物用石油醚振摇脱脂后，加0.01 mo1/L盐酸溶液100 mL溶解，并调pH值至2～3，过滤，滤液加浓氨水调pH值至9～10，再用氯仿萃取数次，合并氯仿层，回收溶剂，残留物即为五脉绿绒蒿总生物碱，加水搅拌稀释至200 mL，备用。

2.2.2 树脂的预处理［4-6］分别取NKA-9、D101、AB-8、DM-301、HPD-100 5种型号大孔树脂，95％乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，再用95％乙醇洗至流出液加适量蒸馏水时，无白色浑浊现象，最后用蒸馏水洗至水液澄清无醇味，备用。

2.2.3 树脂型号对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响［4-5］分别准确称取预处理好的5种型号大孔吸附树脂3份，每份2 g，置于具塞锥形瓶中，加入总生物碱质量浓度为10.18 μg/mL的绿绒蒿提取液10.0 mL，25℃下振摇吸附12 h，再静置吸附12 h，使其达到饱和吸附，过滤，适量蒸馏水冲洗树脂，合并滤液，水浴蒸干，残留物加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL以使其完全溶解，过滤，精密吸取滤液2.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定吸光度，并计算其总生物碱含有量和比吸附量。

取上述吸附已达饱和并冲洗滤出的树脂，再加入95％乙醇50 mL进行解吸，25℃下振摇12 h，再静置12 h，吸取上层液5.0 mL，水浴蒸干，残留物加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取2.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，计算解析液中总生物碱含有量和解析率，结果见表1、图1，计算公式如下。

比吸附量（μg/g）=（C0-Ce）×V/m；比解吸量（μg/g）=C1V/m；解吸附率（％）=比解吸量/比吸附量×100％。其中，C0为起始质量浓度，Ce为平衡质量浓度，V为溶液体积，m为树脂质量，C1为解吸液浓度。

由表1和图1可知，5种大孔吸附树脂的比吸附量按大小，依次为AB-8＞D-101＞NKA-9＞DM-301＞HPD-100；解吸率按大小，依次为AB-8＞D-101＞NKA-9DM-301＞HPD-100。而且，AB-8型树脂的比吸附量为44.15 μg/g、吸附率为86.74％，比解吸量为10.35 μg/g，解吸率为91.39％。由于吸附解吸性能最好，因此选择AB-8型树脂。

表1　树脂型号对绿绒蒿总生物碱富集的影响（n=3）Tab.1 Effects ofmacroporous resin types on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel（n=3）

图1　树脂型号对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响Fig.1 Effects of macroporous resin types on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel

2.2.4 静态吸附时间和静态解吸时间对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响［6-7］精密称取预处理的AB-8型大孔吸附树脂4 g，置于具塞磨口锥形瓶中，精密加入总生物碱质量浓度为10.18 μg/mL的绿绒蒿提取液40.0 mL，25℃下静置，进行吸附。然后，分别在1、2、4、6、8、10、12、24 h时吸取上清液2.0 mL，水浴蒸干，残渣加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，计算上清液中残留总生物碱含有量，并换算成在t时刻内AB-8型树脂对绿绒蒿总生物碱的比吸附量，结果见表2。再以比吸附量（μg/g）对时间t（h）作图，得到AB-8型大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线，见图2。

将吸附24 h后的树脂过滤，蒸馏水冲洗，加入95％乙醇50 mL进行解吸，25℃下静置，1、2、 4、6、8、10、12、24 h时吸取上清液2.0 mL，过滤，蒸干，加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算总生物碱含有量，计算在t时刻内AB-8型树脂的比解吸量，结果见表2。以比解吸量（μg/g）对时间t（h）作图，得到AB-8型树脂的静态解吸附动力学曲线，见图3。

由图2和图3可知，AB-8型大孔吸附树脂静态吸附过程中的比吸附量在8 h后增加缓慢，基本达到平衡，而在静态解吸过程中的比解吸量在10 h后基本达到平衡。结合实际工业生产情况，选择静态吸附时间为10 h，解吸时间也为10 h。

表2　AB-8型大孔吸附树脂静态吸附-解吸附动力学曲线数据（n=3）Tab.2 Data of the kinetic curve of static adsorption and desorption for AB-8 macroporous resin（n=3）

图2　AB-8型大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线Fig.2 K inetic curve of static adsorption for AB-8 macroporous resin

图3　AB-8型大孔吸附树脂的静态解吸附动力学曲线Fig.3 K inetic curve of static desorp tion for AB-8 macroporous resin

2.2.5 解吸剂浓度对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响［8-9］准确称取预处理的AB-8型树脂2 g，置于具塞磨口锥形瓶中，加入总生物碱质量浓度为10.18 μg/mL的五脉绿绒蒿提取液10.0 mL，25℃下静置吸附10 h，过滤，蒸馏水冲洗，合并滤液，水浴蒸干。残留物加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算其总生物碱含有量和比吸附量。

取上述各吸附已达饱和并冲洗过滤的树脂，分别加入100％、90％、80％、70％、60％、50％的乙醇50 mL进行解吸，25℃下静置10 h，过滤，滤液蒸干，残留物加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算其总生物碱含有量和比解吸量，考察其解吸率，结果见表3、图4。

由表3和图4可知，80％以上乙醇水溶液的吸附、解吸附效果较好，解吸率可达90.29％。同时，考虑到随着解吸剂体积分数的增加，解吸下的杂质也会增多，因此选择80％的乙醇溶液作为解吸剂较合理。

表3　解吸剂浓度对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响（n=3）Tab.3 Effects of strippant concentrations on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel（n=3）

图4　解吸剂浓度对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响Fig.4 Effects of strippant concentrations on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel

2.2.6 药液质量浓度对绿绒蒿总生物碱富集的影响［4，9］精密称取15份已预处理好的AB-8树脂，每份2 g，分别精密加入总生物碱质量浓度为20.36、10.18、6.75、5.09、4.07 μg/mL的绿绒蒿提取液10.0 mL，平行3份，静置吸附10 h，过滤，蒸馏水冲洗，合并滤液，水浴蒸干，残留物加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算比吸附量和吸附率，结果见表4、图5。由表4和图5可知，当上样液质量浓度为6.75～10.18 μg/mL时，吸附率较好，因此选择吸附质量浓度6.5～10.0 μg/mL范围内均可。

表4　药液质量浓度对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响（n=3）Tab.4 Effects of soup concentrations on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel（n=3）

图5　药液质量浓度对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响Fig.5 Effects of soup concentrations on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel

2.2.7 动态解吸洗脱液体积流量的选择［10-11］精密称取9份已预处理好的AB-8树脂，每份10 g，湿法装柱，加入五脉绿绒蒿总生物碱含有量为10.18 μg/mL的上柱液20.0 mL，交换吸附10 h，平行3份。吸附饱和后，蒸馏水洗至无色，分别调节体积流量为0.5、1.0、1.5 mL/min，收集溶液，过滤，水浴蒸干，加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算其总生物碱含有量和比吸附量。

取蒸馏水洗至无色的树脂，90％乙醇40 mL解吸，分别调节体积流量为0.5、1.0、1.5 mL/min，收集洗脱液，过滤，水浴蒸干，加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算其总生物碱含有量和比解吸量，考察其解吸率，结果见表5、图6。

由表5和图6可知，在动态解吸过程中，洗脱液体积流量在0.5～1.0 mL/min时，解吸率达80％以上，总生物碱吸附和解吸效果均较好；但再降低体积流量时，吸附量并没有明显提高，说明体积流量过快时，化学成分还未被树脂完全吸附便已流出色谱柱，但过慢则会延长操作周期。同时，考虑到实际生产情况，选择流量为1.0 mL/min。

表5　洗脱液流量对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响（n= 3）Tab.5 Effects of strippant flow rates on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel（n=3）

图6　洗脱液流量对五脉绿绒蒿总生物碱富集的影响Fig.6 Effects of strippant flow rates on the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel

2.3 验证性试验 取已处理好的AB-8树脂30 g装柱，量取总生物碱质量浓度为10.18 μg/mL的五脉绿绒蒿提取液100 mL上样，吸附10 h。先用蒸馏水以1.0 mL/min的体积流量洗涤至洗脱液无色，再用90％乙醇以1.0 mL/min的体积流量洗脱，洗脱液用量为500 mL，收集洗脱液，回收溶剂，蒸干，残渣加蒸馏水100 mL溶解定容。

再精密吸取1.0 mL至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加0.01 mo1/L盐酸5.0 mL使其完全溶解，过滤，精密吸取4.0 mL，按“2.1.4”项下方法测定其吸光度，并计算其总生物碱含有量（μg/mL）。另外，分别精密吸取上述经树脂纯化处理并蒸干重新溶解的溶液25 mL，以及未经树脂纯化的原提取液25 mL，蒸干，称定质量，计算浸膏中总生物碱含有量（μg/g），结果见表6。

表6　大孔树脂纯化五脉绿绒蒿中总生物碱的验证试验（n=3）Tab.6 Verification tests for the purification of total alkaloids from Meconopsis quintuplinervia Regel by macroporous resin （n=3）

由表可知，AB-8大孔树脂纯化绿绒蒿中总生物碱后，所得干浸膏中总生物碱的含有量由172.34 μg/g提高到412.32 μg/g，纯度提高了2.39倍，回收率为79.88％。

3 讨论

现有的消炎止痛药大多主要作用于中枢神经系统，缓解疼痛的作用较强，但其大部分药物反复应用易于成瘾，本课题组期望从植物药中寻找出一种不会成瘾、疗效安全、质量可控的新型消炎止痛药物。经初步研究，绿绒蒿属藏药在消炎止痛方面有其独特的疗效，极有希望开发成为新型的消炎止痛药。本课题组前期已通过耳廓肿胀法、腹腔毛细血管通透性实验及醋酸致小鼠扭体实验，追踪研究了五脉绿绒蒿活性部位，结果显示其原生药中所含的总生物碱与总黄酮均有一定的抗炎镇痛作用，而且前者镇痛作用明显优于后者［10-11］。为了更好地深入研究五脉绿绒蒿总生物碱抗炎镇痛作用机制及量效关系，必须对其进行有效的纯化富集。

大孔吸附树脂具有较好的吸附性能，而且理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物的选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响，解吸容易，再生简单，使用寿命长［12-13］。该填料为吸附和筛选原理相结合的分离材料，对化学成分有选择性吸附，其吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键所产生的，吸附过程主要是被吸附物通过树脂孔径进入树脂内部，被树脂的内表面选择性吸附，所以树脂的比表面积、极性及孔径、成分分子量等是影响吸附效果的主要因素［14-15］，只有合适的孔径和性质，被吸附物才能进入树脂并被有选择性地吸附。因此，不同型号的大孔树脂对不同成分的吸附与解吸能力存在较大差别，应从吸附性能、经济性及生产的实用性等方面综合评价，选择树脂型号。此外，其纯化效果与吸附时间、解吸时间、解吸剂体积分数、上样液质量浓度、流量等因素均有关系，需进行系统考察［14-15］。

在本实验中，所需要富集的是五脉绿绒蒿中的总生物碱部位，在提取过程中，采用碱溶处理方法，将生物碱以游离态提取出来。再以吸附率、解吸率等为指标，考察对比了5种树脂，结果发现AB-8型树脂对五脉绿绒蒿总生物碱吸附解吸的性能最好，因此选择AB-8型树脂。静态吸附和解吸附的动力学曲线显示，静态吸附8 h及解吸10 h后基本达到平衡，结合实际工业生产情况，选择吸附和解吸时间均为10 h。大孔吸附树脂常用的解吸剂是不同体积分数的乙醇，本实验考察了100％、90％、80％、70％、60％、50％这6种不同体积分数乙醇的解吸效果，结果显示80％以上乙醇解吸效果均较好，解吸率可达90％，考虑到随着解吸剂浓度的增加，解吸出的杂质可能也会增多，故选择80％的乙醇溶液作为解吸剂较合理。解吸剂流量过快，则化学成分还未被树脂完全吸附便流出色谱柱，但过慢则会延长操作周期，实验发现，1 mL/min左右的流量较为适宜。上样液质量浓度过高，则溶液过于黏稠，会在树脂颗粒表面形成粘性吸附，严重影响吸附效果；上样液质量浓度过低，则待吸附成分分散在大量溶剂中，减少了与大孔树脂接触吸附的时间，吸附效果也会受到影响。实验显示，上样液质量浓度为6.5～10.0 μg/mL均可。

经AB-8大孔树脂纯化后，所得干浸膏中五脉绿绒蒿总生物碱纯度提高了2.39倍，回收率为79.88％，所得纯化物更容易干燥处理，干浸膏黏度和吸湿性均降低，说明通过AB-8大孔树脂纯化富集后，除去了较多的多糖、蛋白质等成分，提高了提取物中总生物碱的含有量，使药效成分得到有效富集，为藏药五脉绿绒蒿活性部位总生物碱提取物的内在质量提高提供了科学方法，也为后期相应的新药开发研究提供了研究基础。

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［质 量］

*通信作者：郭 玫，女，教授，硕士生导师，从事中药有效成分与质量标准研究。Te1：（0931）8765394，E-mai1：guomeig@sina.com

作者简介：孙政华（1989—），男（苗族），硕士，从事中药有效成分与质量标准研究。Te1：（0931）8765394，E-mai1：412124387@ qq.com

基金项目：甘肃省中医药管理局基金项目（GZK-2008-31）；甘肃省中医药英才基金项目（GZK-2010-52）

收稿日期：2015-09-01

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.016

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0077-07