结核分枝杆菌实验室诊断方法及评价

胡彦综述，陈娟娟，王小中审校(、南昌大学0级卓越医师班，江西南昌330006；、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)



结核分枝杆菌实验室诊断方法及评价

胡彦1综述，陈娟娟2，王小中2审校
(1、南昌大学2012级卓越医师班，江西南昌330006；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

摘要：目前，我国的结核病(tuberculosis，TB)疫情已相当严重，结核病的防治形势亦十分严峻。因而，如何快速诊断、尽早治疗结核病，在控制疫情方面显得尤为重要。近20年，结核病的实验室诊断技术得到了较大的发展，主要有以下三个方面：细菌学检查方法、免疫学诊断技术和分子生物学诊断技术。

关键词：结核病；分枝杆菌；实验室诊断

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）感染，严重危害人类健康的慢性传染病。依据世界卫生组织(WHO)2013年全球结核报告[1]，2012年新发结核病患者约860万例，其中约130万例患者死亡。近年来，我国结核病发病率逐年上升，大约30%的人口感染MTB，其中约10%发展为活动性结核病[2]。目前临床上检测MTB的方法众多，不同方法的临床性能不一[3－5]。由于诊断方法的落后和迟缓使结核病的控制变得复杂而困难。在结核病防治的严峻形势下，早期诊断便成为控制结核病传染的关键因素。

1　细菌学检查

1.1痰涂片染色镜检法

1.1.1萋－尼氏（Z－N）抗酸染色法用萋－尼氏抗酸染液对痰涂片进行染色后，用普通光学显微镜镜检。在100倍油镜下进行观察，发现抗酸杆菌1～8 条/300视野者报告为阳性，全片300个视野未发现抗酸杆菌者报告为阴性。平均每张Z－N染色痰涂片阅片时间为4.4min。袁薇等[6]对658份门诊病人痰标本进行检测，Z－N染色阳性319份，涂片阳性率为48%。国外有文献报道[7]抗酸染色阳性率仅占0%～44%。因该法具有操作简单、检测迅速、价格低廉、特异度高等优点，故成为结核病实验室、特别是低收入且结核病高负担国家的实验室最广泛使用的主要诊断技术之一。

1.1.2荧光染色镜检法其原理为：使用荧光染料对抗酸杆菌进行染色，染色后使用特定波段的光束进行照射，与菌体结合的染料可被激发后产生荧光亮点。常先用20倍物镜对痰涂片进行镜检，发现可疑的荧光杆状物质后，再使用40倍物镜确认，只要求观察50个视野即可。读片时间为1～3min，在阴性结果的玻片上具有明显优势。国外有文献报道[8]，荧光染色法检出抗酸杆菌的敏感度约提高10%，且保持了相似的特异度。

1.2结核菌培养法

1.2.1改良罗氏培养法（L－J法）在接种处理后的痰标本3d、7d分别观察菌落生长情况，然后每周观察结果一次。观察发现菌落生长，经抗酸染色证实为抗酸杆菌后，可报告结核分支杆菌培养阳性，若8周仍无菌落生长，则报告培养阴性。李宁等[9]对1030例疑似结核病患者的3090份痰标本进行培养，阳性率为7.1%，污染率2.1%。该方法具有能保持细菌形态、观察并记录菌落形成过程、对菌落进行定量、进行耐药性试验和菌型鉴定、实验费用低等优点。但同时因耗时长，敏感性不高而限制其实际应用。

1.2.2 Bactec－460TB检测系统其原理为：将痰标本接种于含有14C棕榈酸的7H12B培养基中，用Bactec－460TB仪自动检测分支杆菌的代谢产物14C的放射活性，并换算成生长指数(GI)值，然后对GI值进行分析报告。如果GI升高达某一程度，则报告有分支杆菌生长，即为阳性。国外有文献[10]报道，该方法阳性率约为80%，比传统的改良罗氏培养法明显提高；检测时间约9～14d，明显比改良罗氏培养法缩短。但本方法因底物具有放射性、试剂和仪器设备昂贵而使其推广受限。同时，在药敏试验中，因菌量难定，也在使其标准化困难。

1.2.3 Bactec MGIT960TB检测系统是一种集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。其原理为：将对氧浓度变化高度敏感的荧光显示剂包埋于含有Middebrook7H9液体培养管中，通过测定O2浓度的变化来监测分支杆菌的生长状态。当氧分子被消耗时，培养基的氧化还原电势降低，指示剂则发荧光。在365mm波长的紫外光照射下观察，有荧光出现者则为阳性结果。Katila等[11]报道，MGIT960TB系统对MTB培养阳性率为82.5%～94%，所需的时间为12d左右。该检测方法具有检出率高、特异性强、时间较传统培养法明显缩短等优点。与Bactec－460法相比，无放射性污染，但仪器、试剂更贵，不易在基础诊治单位推广。

1.3噬菌体扩增法其原理为：D29噬菌体侵入标本中活的MTB体内，在菌体内增殖。用噬菌体杀灭剂将游离噬菌体杀死后，加入指示细胞。MTB内的D29噬菌体大量增殖后释放，感染指示细胞，导致指示细胞破裂并在琼脂板上出现噬菌斑。根据噬菌斑的有无，即可确定标本中有无活的MTB。赵庆华等[12]采用噬菌体法和痰涂片法对269例结核住院患者的痰标本进行检测，噬菌体法检测MTB阳性57例，阴性212例；涂片法阳性60例，阴性209例。采用噬菌体生物扩增法检测临床痰标本中的MTB，只要痰标本中有少量的MTB(200～500条/ml)即可被检出[13]。噬菌体法可检测活的MTB，可评价临床治疗疗效，能弥补涂片法不能区分死菌活菌的不足，具有很好的临床应用价值。

2　免疫学诊断技术

2.1 T细胞斑点试验（T－SPOT.TB）是一种简便的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。其原理为：MTB感染后机体内存在具有抗原特异性的记忆T细胞。用早期分泌靶向抗原（ESAT－6）和培养滤过蛋白（CFP－10）刺激后[14]，记忆T细胞迅速活化增殖，并分泌干扰素。在γ－干扰素扩散稀释前，立即捕获细胞周围所分泌的γ－干扰素，以此来计数活化的结核特异效应T细胞。据Diel等[15]的Meta数据分析报道，T－SPOT.TB诊断肺结核的敏感性为85%～90%。Zhang等[16]报道在抗结核治疗1、3、6个月后，T－SPOT.TB阳性率逐月降低，分别为94.4%、86.4%及61.5%，监测效果明显。同时T－SPOT.TB有助于预防性抗结核病的治疗，斑点越多则发生活动性结核的可能性越大，短期内斑点明显增多则提示体内有结核活动[17]。因其目前操作复杂、成本昂贵，使得该方法在临床的推广与应用受限。

2.2酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA法检测是应用血清免疫学检测患者患肺外结核的重要方法之一，在结核病血清学诊断方面研究最多、应用最广[18，19]。其原理为：将抗原或抗体吸附于固体载体模板上，并使标本和酶结合物在其上发生酶催化反应，利用呈色的底物检测抗原抗体。该方法目前还不成熟，其检测所用的抗原因菌种、纯化程度、抗原成分等方面的不同，导致其检测结果的差异性较大，敏感性和特异性也不稳定[20]。Kashyap等[21]采用间接ELISA方法，应用Ag85复合物的单克隆抗体检测血清标本中该抗原。目前国内资料[22]报告其敏感性为88.5%，特异性为97.3%。结核病的血清抗体滴度与临床经过呈正相关。

2.3结明(Myco DotTM)实验结明试剂是美国Dyna-Gen公司的专利产品，结明实验的原理为：脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是一类存在于分枝杆菌表面的糖脂，作为构成分枝杆菌细胞壁的主要成分，是结核病感染过程中重要的免疫反应调节因子，同时也是目前应用最广泛的结核特异性抗原之一[23]。LAM作为抗原固定在电泳梳上，把该电泳梳至于被测血清或全血中，当标本中存在LAM抗体时，则发生抗原抗体结合反应。将已结合抗原抗体的电泳梳至于显色液中，梳上附有抗原处会形成红色圆形斑点，即为阳性。当有结核病活动时，呈阳性红斑，若为有卡介苗接种史、既往结核病史、健康人则无红斑。结明实验操作简单、诊断迅速、无需特殊仪器设备，但因依赖国外进口，导致基层推广受限。

2.4斑点金标免疫渗滤法(DIGFA)其原理为：以硝酸纤维素膜为载体，将分离纯化的MTB特异性外膜蛋白或LAM点样并固化在其上，用于捕获人血清中MTB IgG抗体，采用葡萄球菌A蛋白(SPA)胶体金缀合物标记呈色，在膜上显红色斑者为阳性，白色背景者为阴性。李玉明等[24]利用纯化MTB细胞壁38KDa蛋白抗原来检测胸腔积液中相应的IgG抗体，阳性率为58.9%，显著高于非结核性胸膜炎组(6.6%)。闰国蕊等[25]报道该法特异度为93.0%，灵敏度为71.4%。从以上报道可以看出，DIGFA法具有简便、快速、敏感性高、特异性好等优点。可测定单个标本，且结果稳定，重复性好，适合于医院诊断结核病感染和流行病学的调查。

3　分子生物技术

3.1聚合酶链反应（PCR）其原理为：以待扩增的DNA分子为模板，以一对人工合成的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下使目的片段延伸直至完成新DNA的合成。Elbir等[26]开发出了一种新的方法，在PCR检测前进行DNA的纯化，直接把PCR反应的混合物加入乙醇中，应用IS6110插入序列，检测了44种标本，检测结果全部阳性，简化了试验步骤，降低了操作难度。Sharma等[27]研究发现，在确诊结核组中以IS6110和devR作为引物进行多重PCR检测的阳性率为97.5%。本法的优点：敏感度比培养法高，并已有商品试剂及循环仪供应。缺点：易受外界同源DNA污染，标本中存在抑制物，有较高的假阳性率和假阴性率。

3.2蛋白芯片检测将MTB的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM和经基因工程重组DNA技术生产纯化的结核菌的16000和38000特异性抗原固定在微孔滤膜这一固定的载体上，利用其渗滤、浓缩、凝集作用制作成芯片检测样本血清中相应的MTB IgG抗体。当这三种抗原任一对应的抗体阳性时，即可诊断为MTB感染。米琳[28]报道，确诊为结核病患者中，蛋白芯片检测法阳性率为56.8%。该法具有操作简单、检测迅速、成本较低的优点。但由于其检测的是相应的特异性抗原，故当机体免疫力低下时，其阳性率会受到影响。

3.3 DNA芯片技术该技术是将MTB DNA的保守片段（插入序列IS6110）分数段固定在芯片上，与MTB杂交，以检测MTB。梁桂亮等[29]对109例结核患者标本进行检测，检测出MTB 105例，阳性率为96.33%。Pang等[30]从多方面评价DNA芯片技术在耐多药结核诊断中的价值，结果显示DNA芯片检测利福平耐药的敏感度及特异度分别为87.56% 及97.95%，检测异烟肼耐药的敏感度及特异度分别为80.34%和95.83%，其检测效果优于传统药敏试验，并且高效、快速及安全。该方法具有操作简单、检测迅速、通用量大、可鉴别临床常见的17种分支杆菌。但因其敏感性与芯片的菌种谱、痰标本的菌量有关，故该法受其检测灵敏度的限制。

综上所述，科学技术的飞速发展使得结核病的实验室诊断在多方面取得了很大的进展，发展出了许多新方法和新技术，为结核病的诊断提供了许多用价值的新指标。但部分新技术因其检测成本、操作技术等方面的限制，尚无法在基层推广。希望在广大医务工作者的不懈努力下，结核病的诊断技术能不断完善和发展，提高结核病的早期诊断率，有效控制结核病的传染和改善预后。

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(收稿日期2016-02-23；修回日期2016-03-28)

通信作者：陈娟娟，女，1983年4月生，博士，主治医师，E- mail：moo nlikecj@163.com；王小中，男，1973年12月生，教授，博士生导师。

作者简介：胡彦，女，1995年1月出生，南昌大学2012级卓越医师班，本科在读。

基金项目：国家自然科学基金青年基金（81401964）；江西省青年科学基金（20142BAB215058）；南昌大学创新学分项目（14001849）；江西省教育厅青年基金（GJJ14185）

DOI：10.3969/j.issn.1674－1129.2016.02.016

中图分类号：R378.91+1

文献标识码：A

文章编号：1674－1129(2016)02－0177－03