血蓝蛋白免疫学功能、分子基础与应用新进展

张泽蕙，张佩，章跃陵

（汕头大学理学院生物学系，广东省海洋生物技术重点实验室，广东汕头515063）

血蓝蛋白免疫学功能、分子基础与应用新进展

张泽蕙，张佩，章跃陵

（汕头大学理学院生物学系，广东省海洋生物技术重点实验室，广东汕头515063）

一般认为，血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的一种含铜呼吸蛋白.但随着研究的深入，人们发现血蓝蛋白还是对虾等无脊椎动物中的一种多功能免疫因子.本文对近年来国内外学者在血蓝蛋白免疫学活性、功能多样性分子基础及其应用前景等方面的研究新进展进行概述，为揭示血蓝蛋白在无脊椎动物免疫防御中的作用和地位奠定基础.

血蓝蛋白；免疫学活性；功能多样性分子基础；应用前景

0　引言

血蓝蛋白是位于节肢动物（螯肢类、甲壳类、多足类和蜘蛛类）和软体动物（腹足类和头足类）血淋巴中的含铜呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色[1-2].节肢动物门血蓝蛋白一般由2-8个不同的单体组成，每个单体（由一条多肽链构成）含有630-660个氨基酸残基，分子质量约为70-80 kDa，6个单体在四级结构上联合组成3-3六聚体，或以六聚体为单位再组成复合六聚体（更复杂的球形）[3].而软体动物血蓝蛋白由7-8个在大小上约为50 kDa的相似的功能单位组成，分子量为350-450 kDa，其四级结构为中凹的圆柱体的十聚体、二十聚体或多聚体[4].一般认为，血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，但近年来随着研究的深入，人们发现其不仅具有输氧功能，而且还与能量的贮存、渗透压的维持、蜕皮过程的调节以及表皮的固化有关[5-6].更为重要的是，血蓝蛋白还可通过多种方式参与机体免疫防御，被认为是虾蟹等水产养殖动物中的一种重要的多功能免疫因子，引起国内外学者的高度关注[7-8].因此，积极研究其免疫学活性、功能多样性分子基础及其应用前景，对阐明对虾等水产养殖动物的免疫防御机制，寻找其新的病害防控和良种选育策略等具有重要参考价值.

1　血蓝蛋白免疫学功能

1.1酚氧化酶活性

自德国学者Decker等[9]1998年首次报道狼蛛（Eurypelma californicum）血蓝蛋白具有酚氧化酶活性以来，血蓝蛋白酚氧化酶活性的研究受到国内外免疫学工作者的高度关注，近年各国学者相继发现多种血蓝蛋白在不同激活剂作用下同样具有酚氧化酶活性.Guo等[10]发现软体动物罗曼蜗牛（Helix pomatia）、乌贼（Sepia officinalis）和钉螺（Schistosoma japonicum）血蓝蛋白经α-糜蛋白酶的作用后可表现出O-双酚氧化酶活性.Perdomo等[11-12]报道，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和SDS可诱导眼斑龙虾（Panulirus argus）血蓝蛋白表现出酚氧化酶活性.Kim等[13]研究表明，北海道毛蟹（Erimacrus isenbeckii）体内血蓝蛋白在低温的条件下（2.4-3.4℃），经SDS、脂多糖、磷壁酸等诱导下也可发挥酚氧化酶活性.在此基础之上，Baird等[14]进一步证实，SDS诱导血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的机制可能为：SDS通过其胶束形式诱导血蓝蛋白改变其最佳构象，从而为酚氧化酶底物打开一条通往催化中心的通道.有趣的是，Coates等[15]发现美洲鲎（Limulus polyphemus）体内的磷脂酰丝氨酸与SDS体外诱导血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的机制类似，其在体内同样可激活血蓝蛋白表现为酚氧化酶活性.

此外，学者们还发现血蓝蛋白亚基在一定条件下也可表现出酚氧化酶活性.Fujieda等[16]发现三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血蓝蛋白5个单体均具有微弱的单酚氧化酶活性，且加入3M尿素后，其催化活性还可显著提高.Dolashki等[17]发现软体动物脉红螺（Rapanavenosa）血蓝蛋白功能亚基RvH1-a经SDS、胰蛋白酶以及尿素等处理后，可发挥一定的双酚氧化酶活性.

1.2抗病毒活性

Zhang等[18]率先报道节肢动物斑节对虾（Penaeus monodon）血蓝蛋白对石斑鱼虹彩病毒（Singapore Grouper Iridovirus，SGIV）、蛙病毒3（Frog Virus 3，FV3）、淋巴囊肿病病毒（Lymphocyctis Virus，LDV）等6种病毒具有抗病毒活性.随后，Lei等[19]发现日本对虾（Penaeus japonicus）血蓝蛋白对白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）同样具有抗病毒活性，尤其是发现其2个亚基PjHcL和PjHcY在抵抗WSSV方面存在明显差异，当对虾受到WSSV感染时，PjHcL亚基mRNA表达水平显著上升，而PjHcY亚基变化较小.进一步研究显示，该两个亚基抗病毒功能上的差异可能与其第3功能区上的蛋白质二级结构差异有关.

随后，人们发现不仅节肢动物血蓝蛋白具有抗病毒活性，软体动物血蓝蛋白同样具有抗病毒活性.Nesterova等[20]和Zagorodnya等[21]分别报道软体动物脉红螺、亮大蜗牛（Helix Lucorum）血蓝蛋白具有抗疱疹病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）活性.Dolashka等[22-23]发现脉红螺血蓝蛋白糖基化亚基RvH-c具有抗呼吸道合胞体病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）活性，而非糖基化亚基RvH-b不具备此活性.在此基础之上，进一步发现其另一个亚基RvH2-e的寡糖序列Hex0-9HexNAc2-4Hex0-3Pent0-3Fuc0-3与血蓝蛋白抗疱疹病毒活性密切相关，并推测其作用机制可能为血蓝蛋白通过范德华力或特定氨基酸残基与疱疹病毒糖蛋白特定区域相互作用所致.由此说明，软体动物血蓝蛋白亚基抗病毒活性大小可能与其糖基化程度密切相关.

有意思的是，学者们近年来研究还发现，血蓝蛋白降解片段也可能参与对虾抗病毒免疫.Chongsatja等[24]采用比较蛋白质组学策略，发现凡纳滨对虾（Litopenaeusvanname）感染桃拉综合症病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）24 h后，其血细胞中存在7个血蓝蛋白降解片段表达量的显著变化，其中3/4的血蓝蛋白C-末端片段表达上调，而2/3的血蓝蛋白N-末端片段表达下调.由此提示，血蓝蛋白降解片段可能同样与对虾抗病毒免疫息息相关，至于其是否具有抗病毒活性及其抗病毒的作用机理还有待于进一步研究和证实.

1.3凝集活性

本课题组从2006年开始对凡纳滨对虾、锯缘青蟹（Scylla serrate）血蓝蛋白凝集活性进行了积极的探索，发现其对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水气单胞菌（Aeromona hydrophila）、金黄色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）和大肠杆菌K12（Escherichia coli K12）等7种细菌具有凝集活性，凝集活性大小为0.27-1.08 mg/L（对虾）、7.5-30 mg/ml（青蟹），其凝集活性可分别被N-乙酰神经氨酸和α-D-葡萄糖（对虾）以及N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-半乳糖和D-木糖（青蟹）所抑制.随后，课题组进一步证实，对虾血蓝蛋白发挥凝集活性的构象主要为血蓝蛋白12聚体，与大肠杆菌的凝集作用靶标可能为细菌外膜蛋白OmpX；青蟹血蓝蛋白发挥凝集作用的功能单位为76 kDa亚基，与大肠杆菌的凝集作用靶标可能为两种外膜蛋白：OmpA和OmpC[25-28].由此说明，血蓝蛋白确实具有凝集活性，至于其凝集作用的分子机制还有待于进一步研究和探索.

1.4抑菌活性

Jiang等[29]2007年在《Nature Immunology》首次报道圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）血蓝蛋白对绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）具有抑菌活性，抑菌率为（66.0±5.0）%，其作用机制可能为：血蓝蛋白在外源性微生物蛋白酶的激活下转化为酚氧化酶（其转化率可以被病原相关分子模式——脂多糖和磷壁酸得以加强），然后通过产生活性氧而发挥抑菌活性.

本课题组最近发现，用2种不同抗体亲和纯化所得的2种凡纳滨对虾血蓝蛋白：LHt（抗体为兔抗血蓝蛋白全蛋白）和LH73（抗体为兔抗血蓝蛋白73 kDa亚基）对病原菌的抑菌活性存在显著性差异，其中LH73对副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、鳗弧菌（V. anguillarum）具有明显的抑菌活性，并与LHt相比，具有极显著性差异.进一步探究显示，前者糖含量约为后者的2倍，由此推测，对虾血蓝蛋白糖基化的不同可能是导致血蓝蛋白发挥抑菌活性的另一种分子机制，至于其具体情况还有待于通过对血蓝蛋白糖基的鉴定以及糖基与病原菌的相互作用等进一步研究和证实[30].

同时，本课题组还发现锯缘青蟹血蓝蛋白对溶藻酸弧菌、大肠杆菌K12等细菌均具有抑菌活性，其中对大肠杆菌K12的抑菌作用靶标可能为外膜蛋白OmpX、OmpC、OmpT、Tsx、FadL和OmpW[31].

1.5凝血、溶血活性

本课题组最近发现凡纳滨对虾血蓝蛋白对鱼、鸡、鼠和人等4种红细胞具有显著的凝血活性，其凝血反应可被α-半乳糖、α-D-葡萄糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸所抑制.在此基础之上，我们进一步证实凡纳滨对虾、锯缘青蟹血蓝蛋白还具有溶血活性，其中对虾血蓝蛋白对羊、鼠、鸡、鱼等红细胞溶血活性大小为（34.7-99.9）%，青蟹血蓝蛋白对人、鼠、兔、鸡等红细胞溶血活性大小为（67.3-99.9）%，作用机制可能为胶体渗漏机制[32-33].

值得一提的是，我们采用亲和蛋白质组学技术，进一步发现凡纳滨对虾血蓝蛋白可与人红细胞膜上一种分子量为27 kDa的硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase）特异性结合，且两者在三维结构水平可发生特异性的对接，结合位点呈现典型的“锁-钥模型”.由此推测，硫氧还蛋白过氧化物酶可能为对虾血蓝蛋白与人红细胞结合的靶位之一，所获研究结果为进一步揭示血蓝蛋白的凝血、溶血作用机制等奠定了良好的基础[34].

1.6抗肿瘤活性

研究发现，血蓝蛋白除了可以全方位的参与机体的抗病毒、细菌及异种动物红细胞免疫防御之外，近年来学者们还证实其具有抗肿瘤活性.

Moltedo等[35]报道鲍鱼（Concholepas）血蓝蛋白对膀胱癌细胞MBT-2具有抗肿瘤活性. Becker等[36]进一步发现鲍鱼血蓝蛋白不同亚基的抗肿瘤活性存在差异，其中分子量为405 kDa的亚基CCHA对MTB-2的抗肿瘤活性明显优于分子量为350 kDa亚基CCHB，并推测CCHA亚基之所以具有较好的抗肿瘤活性是由于其具有更好的亲水性和更高的糖含量等所致.Boyanova等[37]证实脉红螺、亮大蜗牛血蓝蛋白对人膀胱癌细胞具有抗肿瘤活性，且它们可以作为一种替代药物用于人浅表膀胱癌的治疗.Antonova等[38]发现螺旋蜗牛（Helix aspersa）血蓝蛋白对膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症具有抗肿瘤活性.Sarker等[39]证明钥孔血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）可以通过增强自然杀伤细胞（Natural Killer，NK）的活力和促进细胞因子的产生来抑制病毒肉瘤细胞（Meth A sarcoma cells）的增殖.我们发现凡纳滨对虾血蓝蛋白对人宫颈癌细胞（Hela）同样具有明显的抗肿瘤活性，推测其作用机制可能为：对虾血蓝蛋白通过产生活性氧诱导肿瘤细胞以细胞程序性凋亡机制抑制肿瘤细胞生长[40].

2　血蓝蛋白功能多样性的分子基础

通过以上叙述可知，血蓝蛋白是近年来在无脊椎动物中新发现的一种具有多种免疫学活性的非特异性免疫因子.但血蓝蛋白分子为何可以同时识别、抵抗包括病毒、细菌、真菌、异种动物红细胞和肿瘤细胞等在内的多种不同病原体这个问题尚不是很清楚.可喜的是，最近人们对其进行了积极的探索.

Cong等[41]证实帝王蝎（Pandinus imperator）血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性是由于血蓝蛋白空间构象改变而使酶活性中心暴露所致.Jiang等[29]认为鲎血蓝蛋白发挥抑菌活性是其酚氧化酶活性产生活性氧的结果.我们在既往研究中发现凡纳滨对虾血蓝蛋白之所以可以发挥免疫学活性是由于其在结构上存在1个长约250 bp左右的Ig-like区所致，该功能区在序列上与人Ig及其它免疫分子存在多个同源区域，在功能上可与抗人Ig和病原菌、异种动物红细胞发生特异性的结合，推测血蓝蛋白是一种新型的IgSF分子[42-43]，并进一步发现凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥凝集、溶血活性主要与其聚集体的大小有关[32-33].最近包括我们课题组在内的学者们在上述研究基础之上，进一步发现血蓝蛋白之所以可以同时识别、抵抗多种病原微生物，可能与其在核酸、蛋白质和糖基化修饰等不同水平具有分子多态性有关.

本课题组Zhao等[44]、Guo等[45]分别发现凡纳滨对虾血蓝蛋白大、小亚基C-末端存在13、11个SNPs位点，且与对虾免疫防御及对病原微生物的抗性提高密切相关.随后，本课题组郭玲玲[46]和Zhao等[47]在凡纳滨对虾体内进一步发现了多个N段变化丰富的血蓝蛋白大亚基变体和1个小亚基内含子滞留选择性剪切体的存在，在功能上这些血蓝蛋白变体或剪切体与对虾抵御不同病原微生物的入侵有关.

本课题组乔杰[48]采用亲和蛋白质组学策略发现与副溶血弧菌等6种病原菌相结合的血蓝蛋白，不仅在2-DE/2-D Western-blotting图谱上存在明显差异，而且其抑菌、凝集和溶血等免疫学功能差异显著，提示血蓝蛋白在蛋白质水平同样存在多态性，并与血蓝蛋白识别不同病原微生物、发挥不同免疫学活性以及对虾抵抗不同病原微生物的感染密切相关.

Dolashka等[22]报道脉红螺血蓝蛋白抗病毒活性的发挥与其糖基化修饰有关.Olianas等[49]通过分析钙离子、pH值、乳酸盐等对粒背馒头蟹（Calappa granulata）血蓝蛋白结构的影响发现，血蓝蛋白具有多种功能可能是由于血蓝蛋白的蛋白质结构具有多种翻译后修饰的结果.我们采用亲和层析技术获得5种糖含量不同的凡纳滨对虾血蓝蛋白组分，其凝集、溶血活性存在显著差异[50].

从以上分析可知，虽然迄今为止血蓝蛋白功能多样性的分子基础及其作用机制尚不十分明确，但随着血蓝蛋白分子多态性、基因表达调控以及信号传导途径等研究的深入，相信血蓝蛋白功能多样性的分子机制必将彻底阐明.

3　血蓝蛋白在免疫防御中的应用

1974年Olsson等[51]率先发现匙孔血蓝蛋（KLH）可用于浅表性膀胱癌患者的治疗.随后，Lamm等[52-53]发现KLH还可通过肿瘤转移之前的免疫作用或肿瘤转移之后的病灶内治疗，达到免疫治疗膀胱移行细胞癌的目的，并进一步通过临床实验证实，KLH是一种安全高效的膀胱癌免疫治疗物.Campo等[54]还发现KLH可以作为一种非特异性免疫刺激物，激活哺乳动物的免疫防御反应，并有望作为一种抗原用于抗癌疫苗的研发.Guo等[55]研究证实湖北钉螺（Oncomelania hupensis）血蓝蛋白与日本血吸虫（Schistosoma Japonicum）具有相同的抗原表位，提示其可以作为一种潜在的疫苗进行血吸虫病的诊断与治疗.Gesheva等[56]报道海产腹足类动物红螺血蓝蛋白（Rapana thomasiana hemocyanin，RtH）是一种良好的免疫生物佐剂候选物.

通过上述资料分析可知，血蓝蛋白在抗肿瘤治疗、疫苗研发等方面具有重要的潜在的应用价值.基于血蓝蛋白的功能多样性，我们有理由认为，随着对血蓝蛋白免疫学功能及其作用机制研究的深入，血蓝蛋白在生物医学、水产养殖等方面将具有更广阔的应用前景.

4　研究前景与展望

综上所述，血蓝蛋白作为节肢动物、软体动物血淋巴中的主要蛋白，在无脊椎动物的免疫防御中发挥了重要的作用.虽然学者们对血蓝蛋白的免疫学活性、功能多样性的分子基础及其应用等有了较深入的了解，但血蓝蛋白发挥免疫学功能的相关信号传导途径、功能多样性的分子机理，及其基因转录表达调控的分子机制等尚不清楚.为此，笔者认为进一步对血蓝蛋白的这些科学问题进行积极的研究，对于揭示虾、蟹、贝类等水产养殖动物的免疫防御机制，选育抗逆优良水产养殖动物品种，建立水产养殖动物病害的生态学防治方法等具有重要的理论意义和实际应用价值.

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Advancement on the Immune Function, Molecular Basis Underlying Multifunctionality and Application of Hemocyanin

ZHANG Zehui,ZHANG Pei,ZHANG Yueling
（Department of Biologyand GuangdongProvincial KeyLaboratoryof Marine Biotechnology, College of Science,Shantou University,Shantou 515063,Guangdong,China）

Hemocyanin is a large,copper-containing protein in the hemolymph of both mollusk and arthropod.The traditional role of hemocyanin is the transport and storage of molecular oxygen.Lately,it is demonstrated that hemocyanin is a novel multifunctional protein,especially participating in multiple roles of immune defense.In the present review,its new progress in the immune function,molecular basis underlying multifunctionality and application prospect in the recent years are dcscussed.The results will assist in the investigation of the role and function of hemocyanin in the invertebrate immunity.

hemocyanin;immune functions;molecular basis underlying multifunctionality; application prospect.

Q71

A

1001-4217（2016）01-0046-09

2015-04-22

张泽蕙（1990—），女，硕士生，主要从事水产动物免疫生物学研究.E-mail:13zhzhang1@stu.edu.cn

章跃陵（1971—），教授，博士生导师.E-mail：zhangyl@stu.edu.cn

国家自然科学基金项目（31372558）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-11-0922）；广东省自然科学基金项目（S2013010015190）；广东省高等学校科技创新重点项目（2012CXZD0025）.