动物源性食品中喹诺酮类残留前处理及分析方法的研究进展

张　元,周伟娥,李绍辉,郑　阳,周　昱,张　峰,冯雪松,*

(1.中国医科大学药学院,辽宁沈阳 110013;2.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京 100176)



动物源性食品中喹诺酮类残留前处理及分析方法的研究进展

张元1,2,周伟娥2,李绍辉2,郑阳2,周昱1,张峰2,冯雪松1,*

(1.中国医科大学药学院,辽宁沈阳 110013;2.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京 100176)

喹诺酮类兽药残留是目前重要的动物源性食品安全问题之一,检测食物基质中痕量兽药残留依赖于有效的前处理方法和精密的分析仪器。本文阐述了喹诺酮类兽药的研究背景和现状,并对国内外食品中喹诺酮类兽药残留的液液萃取(Liquid-Liquid Extraction,LLE)、固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)、基质辅助固相分散萃取(Matrix Solid-Phase Dispersion,MSPD)、QuECHERs(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe,QuECHERs)、超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)和免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography,IAC)等前处理方法及液相色谱质谱法、液相色谱法、毛细管电泳分析方法及免疫分析测定法等检测方法进行了综述,拟为动物源性食品中喹诺酮类药物的残留监控提供理论参考,综述指出SPE和QuECHERs为最有前景的前处理方法,而质谱技术的发展和仪器的小型化为检测仪器的发展趋势。

动物源性食品,前处理技术,检测,喹诺酮兽药残留

喹诺酮类药物类(quinolones,QNs)是人工合成的具有1,4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构基本结构的一类药物的总称。该药作为抗生素已有超过50年的使用历史,主要通过阻断特异性拓扑酶,抑制细菌DNA复制而发挥抗菌作用[1],该药具有价格低廉、抗菌谱广、无交叉耐药性等诸多优点。目前在临床及兽药领域均有着极其广泛的应用[2]。由于喹诺酮类药物在预防和治疗过程中的不规范使用,许多动物源性食品常存在该类药物的残留。鉴于此,人类往往成为了该类药物的“被动吸收者”。喹诺酮类药物能够致癌、致畸、致突变,同时能够用引发胃肠道及神经系统不良反应等,人类若大量服用,往往具有很大的风险[3-5]。一旦喹诺酮类药物在肉、蛋、乳等各类动物源性食品中发生残留,一方面,残留的药物可能对人体健康造成潜在的危害;另一方面,兽药残留也会阻碍动物源性产品的进出口贸易。我国农业部规定动物肌肉组织中环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹的最高残留限量(maximum residue limit,MRL)在10～50 μg/kg,美国则禁止在食用动物养殖过程中使用氟喹诺酮类药物[6]。

目前在食品安全领域,大量关于喹诺酮类药物检测的研究已开展,如牛奶[7-8]、鸡蛋[9-10]、肉类(猪、牛、羊、鸡)[11-12]、鱼及水产品[13-14]等。有学者[15]对各类抗生素作为兽药或饲料添加剂的使用量进行了统计研究,指出氟喹诺酮类药物是目前使用量最大的兽药抗生素之一,在对多种食品进行兽药残留检测后发现,氟喹诺酮类以检出率19%略微落后于磺胺类药物,在各类兽药抗生素残留检出率排行中位居次席[15]。目前动物源性食品中喹诺酮类抗生素残留的前处理和分析方法取得了较大进展,相关报导层出不穷,但近年内该领域取得的最新进展尚无较系统的综述,对该领域进行综述不仅有助于研究者把握最新研究现状,更能够协助研究者在现有研究基础上针对性地开展深入研究。因此本文拟对近5年内动物源性食品中喹诺酮类抗生素残留的前处理和分析方法进展进行综述,以期为动物源性食品中喹诺酮类兽药残留监控提供依据。

1　动物源性食品样品前处理

建立复杂基质中喹诺酮类药物残留的检测方法,前处理是极其重要的一环。前处理不仅要最大限度地提取待测目标物,还需要最大程度地减小杂质的存在,从而降低基质干扰,降低检测限。截止目前,不同喹诺酮类药物的前处理方法被相继开发,常见的有液-液萃取[16-19](LLE)、固相萃取[20-24](SPE)、基质辅助固相分散萃取[25-27](MSPD)、“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全”的萃取方法[11,28-29](QuECHERS)等,以下分述之。

1.1液-液萃取(LLE)

液-液萃取主要基于分析物在不同溶剂间的分配系数不同的原理,亦可通过控制pH调节药物在两相中的分配。乙酸乙酯、正己烷等均为常见的有机萃取溶剂。彭涛等[16]建立了同时测定鸡肉中5种喹诺酮类药物的液质联用方法,磷酸盐缓冲溶液和乙腈混合溶液提取后,采用正己烷液液分配净化除去脂肪,随后经C18柱净化后经液相色谱串联质谱(liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,LC-MS/MS)检测,结果表明5种喹诺酮类药物回收率在79.8%～95.1%之间,检出限在0.1～1 μg/kg之间。占春瑞等[17]在测定鸡肉中喹诺酮类物质时也采用正己烷液液分配去除鸡肉中脂类杂质,方法的检出限可低至2.2～3.7 μg/kg,而回收率可高达78.3%～101.8%。

然而,LLE操作费时、选择性差、消耗高纯溶剂多,不符合现代化仪器分析的发展趋势,且部分样品会发生乳化现象而影响测定,目前应用逐渐减少,且已逐步被SPE代替。但近年来在其基础上,液液分散微萃取(Dispersive Liquid-Liquid Micro-extraction,DLLME)作为一种新型微萃取技术被提出,该法操作简单、快速、准确、对环境友好,短短几年取得了较大的研究进展,Junza等[18]建立了同时测定牛奶中17种喹诺酮和14种β-内酰胺类抗生素的HPLC-MS/MS方法,沉淀蛋白后,1070 μL乙腈作为分散剂,570 μL三氯甲烷作为萃取剂,萃取时间60 s,然后离心并行上机检测,方法的检出限可低至4.1～104.8 mg/kg,而回收率可高达72%～110%,研究还考察了不同因素对提取效率的影响,发现萃取剂和分散剂的体积及性质、pH及盐浓度值、萃取时间和离心时间均对提取效率有一定影响。Moema等[19]亦采取DLLME法净化鸡肝,随后采取高效液相色谱对6种氟喹诺酮类药物进行检测,净化过程中分别优化了分散剂类型及体积、萃取剂类型及体积、盐种类、浓度和pH等因素对萃取效率的影响,最终选取1 mL乙腈作为分散剂,200 μL三氯甲烷作为萃取剂,涡旋30 s,离心5 min,该法测定鸡肝中6种氟喹诺酮类药物回收率高达83%～102%,定量限低至5～19 μg/kg之间。

1.2固相萃取(SPE)

固相萃取主要基于固体吸附剂将目标物吸附,从而实现目标物与干扰物质的分离和富集。操作步骤主要有前处理(均质、离心等)、活化及上样、不同洗脱剂洗脱及回收待测物四个主要步骤。常见的固相萃取填料有硅胶、氧化铝和C18等。Jiménez-Díaz等[20]采用Isolute ENV SPE柱对猪肉组织进行净化,进而分别采用荧光检测器、液相色谱质谱及液相色谱串联质谱使用全面检测其中8种喹诺酮类药物,三种检测器的检出限分别为0.1～2.1、0.3～1.8、0.2～0.3 ng/g。侯建波等[21]建立了蜂蜜中6大类54种药物(含15种喹诺酮)残留的液相色谱串联质谱方法,样品经磷酸盐缓冲液提取后,采用Oasis HLB 固相萃取柱净化,随后上机检测,该法对喹诺酮类定量限达2.0 μg/kg,回收率也符合检测要求。Galarini等[22]建立了符合欧盟2002/657法规的蜂蜜中27种抗生素(包含喹诺酮类)残留的筛查和确证方法,样品经水解和脱脂后,采用Strata-X-C强阳离子柱进行净化,随后上机检测,该方法定量限低至0.23～2.0 μg/kg。达到欧盟2002/657法规要求。

固相萃取法有机试剂消耗量低、回收率高、分离效果好、操作简单,同时可用于小体积样品。但是其富集倍数有限,对于部分基质中的杂质,净化方法尚未开发完成。近年来,在固相萃取技术基础上,固相微萃取技术被提出且已取得一定的发展。该法主要利用待测物在基体和萃取相间的非均相平衡,使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层,继而进入仪器进行分析。相比SPE,该法具有更大的萃取表面积和更薄的固定相膜,且操作更为简便。Gajda等[23]建立了同时测定鸡蛋中7种喹诺酮类药物残留的荧光定量方法和质谱确证方法,采用固相微萃取对样品进化,乙腈作为萃取剂,荧光方法回收率在85%～93%之间,定量限可达17～43 μg/kg;质谱法回收率在92%～99%之间,定量限可达7～11 μg/kg。

近年来,在常规SPE基础上,磁性固相萃取技术(magnetic-solid phase extraction,M-SPE)作为一种“革命性”技术应运而生,该技术采用磁性或者可被磁化的物质作为吸附剂,相较常规SPE填料,纳米填料比表面积更大,扩散距离更短,只需要使用少量的吸附剂就能实现低浓度的微量萃取,具有平衡时间短、萃取能力强、萃取效率高等优点。Ibarra等[24]采用毛细管电泳法测定牛奶中7种喹诺酮类药物,样品采取M-SPE技术进行净化,实验中比较了磁性吸附材料的种类、用量及样品pH对萃取效率的影响,牛奶净化后上机检测,方法检出限在9～12 μg/L,回收率高达74%～98%。

1.3基质辅助固相分散萃取(MSPD)

基质辅助固相分散萃取最早于1989年被提出[27],该方法常用于液体或者粘稠样品,对于部分含有脂类的原料也适用,该法首先将样品和填料混合研磨,以使样品在固定相颗粒表面均匀分散,从而获得半固态样品,进行装柱并通过不同洗脱淋洗液进行洗脱而对目标物进行净化,

基质固相分散是将样品与填料一起混合研磨,使样品均匀分散于固定相颗粒表面,制成半固态后装柱,然后根据“相似相溶”原理选择合适的淋洗剂洗脱出各种待测物。该法将匀浆、提取和净化等多个步骤融为一体,有效减少了样品损失。Yu等[25]建立了同时测定猪肉组织中喹诺酮类、磺胺类和四环素类兽药残留的高效液相色谱方法,实验中采用MSPD法对样品进行净化,2 g C18、0.05 g乙二胺四乙酸二钠和0.05 g草酸加入样品中轻微搅拌均匀装柱,正己烷除脂,乙腈∶二氯甲烷(v/v:1∶1)洗脱目标物,该法回收率在80.6%～99.2%之间,定量限在7～34 μg/kg。Duan等[26]建立了测定鸡蛋中恩诺沙星的流动注射化学发光测定方法,样品亦采用MSPD法进行净化,氟罗里硅土作分散吸附剂,二氯甲烷洗脱目标物后进行检测,检出限可低至5 ng/L。Wang等[27]同时采用高效液相-荧光检测器测定了猪组织中5种喹诺酮类药物,0.5 g猪肉组织中加入2 g C18均质,随后分别以1 g无水硫酸钠、0.25 g C18、样品和C18均质物、0.5 g无水硫酸钠装柱,正己烷洗脱除脂,最后以乙腈洗脱目标物待测,该法回收率在60.1%～107.7%之间,检出限在9～22 μg/kg,能较好地满足检测需求。

综上,MSPD法萃取净化效率高、溶剂和样品用量低、节省时间。但该法不易标准化,主要受制于研磨的粒度大小不同,以及填装技术有较大差别。

1.4QuECHERs方法

近年来食品中喹诺酮类兽药残留的QuECHERs方法也被开发出来,QuECHERs方法将提取、分离和净化等多个步骤融合为一步,可以减少实测样品用量,减少试剂和耗材消耗,同时节省操作人员的精力和时间,此外,QuECHERs方法具有较广的样品检测范围,对于各种食品,如果蔬、植物、谷物、肉类等均可以采用,目前欧盟已将该法写进标准:EN 15662-2007[28]。

QuECHERs方法在分离萃取喹诺酮类药物时,有着较好的效果。Lombardo-Agüí等[29]采用QuECHERs前处理结合荧光检测器同时测定鱼中8种喹诺酮类药物残留,采用SampliQ QuECHERS Kit隔水独立包装盐袋(含4 g硫酸镁,1 g氯化钠,1 g 柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢钠)进行净化处理,该法检出限0.1～4.7 μg/kg,回收率在72%～108%。Lombardo-Agüí等[30]还建立了QuECHERs前处理结合液质联用测定蜂蜜样品中8种喹诺酮类药物的方法,该法检出限在0.2～4.1 μg/kg。Rocha等[11]建立了QuECHERs前处理结合高分辨质谱测定猪肉和猪肝中12种喹诺酮类药物的方法,实验中采用33Box-Behnken响应面分析法优化了QuECHERs方法,萃取相的组成、萃取相中乙酸含量及萃取相使用量,最终选取50 mg(C18/PSA:1/1,w/w),5%冰醋酸(v/v),该法回收率在88.8%～112.2%之间,符合检测要求。

综上所述,QuECHERs方法能符合现代分析要求。为了简化和优化该方法在兽药领域内的应用,很多研究者对传统QuECHERs方法进行了改进以使分离喹诺酮类药物时效果更好,均取得了较好的效果。

1.5其他

近年来,超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)也成为热点研究领域之一,流体在超临界状态时往往具有密度大、粘度低及扩散系数大等优点,SFE正是基于上述原理将待测组分从基质中洗脱出来的萃取方法,该方法集萃取和分离为一体,能显著减少待测物损失。Shim等[31]建立了SFE前处理结合液相色谱测定鸡蛋中4种喹诺酮类药物的方法,首先使用超临界CO2去除干扰杂质,随后使用含20%甲醇的超临界CO2萃取目标物,该法回收率高达83%～96%。Shen等[32]建立了SFE前处理结合液相色谱测定鸡肉中2种喹诺酮类药物的方法,对比优化了不同提取参数对萃取效率的影响,同样选用含20%甲醇的超临界CO2萃取目标物,该法回收率也高达70%～87%之间。除此以外,免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography,IAC)也被一些学者提出用于喹诺酮类药物的检测,亦取得较好的效果。该法基于抗原与抗体特异性、可逆性结合的特点,首先将抗体与惰性基质偶联并装柱,上样后杂质因无吸附而直接洗脱去除,再经适当溶剂洗脱待测物,该法选择性强,由其适用于复杂基质。赵思俊等[33]建立了免疫亲和色谱-HPLC-FLD测定鸡肉中10种喹诺酮类药物的方法,优化了免疫亲和色谱操作条件对样品进行净化,该法回收率达74.7%～94.8%,检出限达0.05～0.15 μg/kg。

2　动物源性食品样品检测技术

目前复杂基质中喹诺酮类药物的检测技术已经取得很大进展,借助于灵敏度较高的分析仪器,如高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、液质联用等,药物检出限和定量限均能满足各国出入境、食品药品监督管理局及相关机构的检测要求。

2.1液相色谱质谱法

在HPLC串联的各种检测器中,串联质谱由于灵敏度和选择性高于其他检测器,目前应用较为广泛。质谱技术可以对通过色谱无法分离的物质进行定量,且具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。尽管如此,在定量时,实验者仍然需要尽可能地优化色谱条件以对目标化合物进行分离,从而降低杂质对待测物产生的基质效应。

目前各种食品基质中喹诺酮类药物的质谱检测方法均有报道。Han等[7]建立了同时测定牛奶中喹诺酮等38种兽药残留的方法,该方法定量8种喹诺酮类药物,检出限低至0.01～0.3 μg/kg,定量限达0.03～0.6 μg/kg,取得了检测效果。孟哲等[8]也建立了高灵敏度和选择性的测定乳制品中8种氟喹诺酮类和5种磺胺类兽药残留的高分辨质谱法,喹诺酮定量限分别达到0.5～0.8 μg/L,能够很好的满足测定需求。Rocha等[11]采用高效液相串联高分辨质谱同时测定猪肉和猪肝中的12种喹诺酮类药物,该法检测限(CCα)达100.1 ～106.4 μg/kg,定量限(CCβ)到100.2～112.7 μg/kg,也能够满足测定要求。然而质谱方法存在的最主要的问题就是仪器成本高且对操作人员要求极高,在多数基层食品安全检测部门使用仍然较难,同时,由于质谱仪器与许多流动相不“兼容”,流动相的选择也相对“挑剔”。

2.2液相色谱法

反相高效液相色谱-紫外或荧光检测器为经典的喹诺酮类药物的分析方法,目前在食品残留领域仍然有着极其广泛的应用。但无论荧光检测器还是DAD检测器通常只能用作定量分析,而无法直接提供待测物的结构或化学组成。

邓思维等[2]建立了纳米纤维固相萃取-高效液相色谱-荧光检测麻辣烫汤液中喹诺酮类药物的方法,样品经固相萃取净化后,上机检测,激发波长280 nm,发射波长450 nm,该法定量限(LOQ)为3.9～18μg/L。Jiménez等[9]建立了鸡蛋中9种喹诺酮类残留的确证方法,0.01mol/L草酸水溶液和乙腈作为流动相,柱温25 ℃,马波沙星激发波长为297 nm,发射波长507 nm,诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星激发波长和发射波长分别为280 nm和458 nm,恶喹酸激发波长和发射波长分别为263 nm和380 nm,氟沙星则分别为248 nm和361 nm,该法检出限和定量限分别为0.2～19.8 μg/kg和0.4 ～33.5 μg/kg。Sun等[13]也采取高效液相色谱串联荧光检测器(Fluorescence Detector,FLD)测定了鱼中多种喹诺酮类残留,激发波长和发射波长分别选取为290 nm和480 nm,定量限在0.06～0.22 μg/kg。Moema等[19]则采取了HPLC-DAD检测了鸡肝中6种喹诺酮类药物残留,检测波长选定在280 nm,方法定量限5～19μg/kg。

液相色谱法过程中待测物在色谱中实现分离是必不可少的一环,不同填料的色谱柱应用于该类药物的分离均有报道,目前反相柱(由其是C18或者C8柱)应用较广。流动相也是实现喹诺酮类药物分离的重要影响因素之一,最常采用的流动相组合为乙腈-水或甲醇-水等。除此以外,邓思维等[2]也采用甲醇-水-磷酸三相组合(25∶75∶0.1,v/v)的流动相进行分离,取得了较好的分离效果。Jiménez等[9]采用0.01 mol/L草酸水溶液和乙腈作为流动相,38 min内实现了对9种喹诺酮类药物的充分分离。调节流动相pH也是保证峰形,改善分离度的影响因素之一,因此很多学者在建立喹诺酮类药物分析方法的同时,也常采用甲酸或者乙酸或者引入缓冲盐以达到调节并控制pH的良好效果,邓思维等[2]采用三乙胺溶液调节pH至2.8用于促进喹诺酮药物的电离,改善峰形拖尾,提高分离效果。除了上述影响因素以外,不同的梯度条件也是极其重要的。

2.3毛细管电泳分析方法

毛细管电泳方法也是一种较好的定量分析方法,在样品量很小的时候具有较多优势,该方法分离效能高、试剂、耗材消耗少,同时能实现多物质的同时检测。Ibarra等[24]采用毛细管电泳法同时测定了牛奶中7种喹诺酮类药物,分别采用40 mmol/L 磷酸盐缓冲液作为流动相,在15 kV电压下,10 min内7种喹诺酮类抗生素取得了很好的分离,该法检出限在9～12 μg/L。周梅仙等[34]建立了高效毛细管电泳检测鸡蛋中环丙沙星、氧氟沙星和恩诺沙星3 种喹诺酮类抗生素的测定方法,缓冲液为pH8.53的30 mmol/L Na2B4O7-10 mmol/L KH2PO4溶液,分离电压为18 kV,温度为25 ℃,选定检测波长280 nm,3种抗生素在12 min内实现基线分离。

2.4其他分析方法

免疫分析测定法是一种较新型的检测方法,该法具有专属性高、灵敏度高、操作简易、成本低的优点,在日常分析中应用非常广泛。该方法基于抗原与抗体相结合的原理,可在较短时间内实现对少量残留物质的测定。关于免疫分析法测定喹诺酮类药物已有较多报道,Jiang等[35]建立了双色酶联免疫吸附法检测牛奶中喹诺酮类药物的方法,该方法有较大的创新性,文章中首创使用两种不同的酶:碱性磷酸酶(ALP)和辣根过氧化物酶(HRP)同时检测两种不同低分子量的化学成分,该法对喹诺酮类的检出限低至2.4 ng/mL。

3　结论和展望

在过去5年中,不同食品基质中喹诺酮类药物残留的不同分析检测方法相应已被开发,无论在食品、环境样品及药物分析中均有相关报道。在分析过程中,研究的热点主要集中在待测物提取和净化步骤的改进。其中最能实现该目标的前处理方法一般认为是QuEChERS和SPE技术,这两种技术的优势都包括低试剂消耗及高通量,因此,这些技术有望在未来取得较大突破。

目前提出的分析方法主要基于HPLC串联(多级)质谱,因此在高效液相色谱串联质谱仪上取得相应进展也将有助于我们取得更好的残留筛查目的。目前的研究趋势是质谱检测器与现代化的色谱技术(比如超高效液相色谱)联用,同时飞行时间质谱仪(Time of Flight Mass Spectrometer,TOF)和轨道阱质谱仪(Orbitrap Mass Spectrometer)也是更为有效的检测工具,随着仪器的飞速发展,痕量有机物包括喹诺酮类物质的定性定量及多残留筛查均取得了较大的进步,但这些仪器仍然具备价格昂贵且运行维护成本高的问题,为了降低成本,缩短分析时间,很多微生物学测定方法、免疫法及生物传感器测定方法被相继开发出来,仪器的小型化及自动化同样也是研究的热点领域之一,相信随着研究的进展,在不久的将来在分析仪器及前处理领域均会取得较大的突破。

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Research progress in pretreatment technologies and detection methods of quinolones residues in foods

ZHANG Yuan1,2,ZHOU Wei-e2,LI Shao-hui2,ZHENG-Yang2,ZHOU Yu1,ZHANG Feng2,FENG Xue-song1,*

(1.School of Pharmacy of China Medical University,Shenyang 110013,China;2.Institute of Food Safety of Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China)

Quinolones residue is currently one of important problems in animal-derived food safety. The detection of quinolones in a complex food matrix mainly relies on an effective pretreatment method and precision instruments. This paper summarized the research background and status of quinolones,and reviewed the research progress in China and other countries on pretreatment technologies,such as liquid-liquid extraction,solid-phase extraction,matrix solid-phase dispersion,QuECHERs,supercritical fluid extraction and immunoaffinity chromatography and detection methods,such as high performance liquid chromatography-tandem mass,high performance liquid chromatography,capillary electrophoresis and immunoassay,this review could provide reference of monitoring quinolones residues in food. The review suggests that SPE and QuECHERs are most promising pretreatment methods,and the development of mass-spectrometric technique and the miniaturization of instrument will be a development trend.

food;pretreatment technology;detection;quinolones residues

2015-04-23

张元(1990-),男,在读硕士,研究方向:分析化学及药物分析,E-mail:13840149878@163.com。

冯雪松(1968-),男,博士,副教授,研究方向:药物分析,E-mail:voncedar@126.com。

国家重大科学仪器设备开发专项项目(2012YQ14000806);国家质检总局科技计划专项(2014Ik084);北京市科技计划课题(Z141100002614020);质检公益性行业科研专项分项目(201410088-02);辽宁省科学技术厅自然科学基金(201202252)。

TS251.1

A

1002-0306(2016)05-0378-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.069