鱼类肠道微生物研究进展

翟万营，郭安宁

（1上海海洋大学，省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；2上海海洋大学，水产与生命学院，上海 201306）

鱼类肠道微生物研究进展

翟万营1,2，郭安宁1,2

（1上海海洋大学，省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；2上海海洋大学，水产与生命学院，上海 201306）

肠道微生物种类和含量丰富，对机体生长发育具有重要影响。鱼类作为脊椎动物的重要组成部分，其生活在水体环境中，肠道微生物容易受到食物、压力、宿主生长发育、环境等影响，同时对机体的营养、生长、和免疫等都有重要作用。本文综述近年来国内外对鱼类肠道微生物的研究进展，阐述鱼类肠道菌群的影响因素、肠道微生物对机体营养代谢、免疫调节等的影响，以期为鱼类等水生动物的生态健康养殖提供理论支撑，推动水产养殖业的可持续发展。

鱼类；肠道微生物；核心菌群；宿主

肠道微生物在动物体内数量庞大，结构复杂，与宿主相互依赖、相互制约，经过长期进化，与宿主肠道形成了一个特定的肠道微生态系统，有相当一部分微生物长期定居在动物肠道中，具有营养、防御和免疫调节等生理功能，并且对机体的生长发育具有重要影响[1]。

正常人体肠道微生物数量有近1014个，超过人体自身细胞的10倍以上，对营养物质代谢、机体自身发育、免疫及疾病的产生等方面都起到极其重要的作用，而且很多研究结果都表明肠道微生物和多种疾病发病直接相关，如癌症、肥胖、神经变性疾病等。

脊椎动物的肠道微生物种群构成受饮食、营养状态和发育阶段、健康情况的影响。鱼类作为水生动物的重要组成部分，占将近一半的脊椎动物物种，由于肠道微生物与所处的肠道环境及鱼体生活的水体环境紧密相关，与陆生脊椎动物相比，因其处在更为复杂的生态环境之中，更容易受到食物供给、环境变化（如温度、盐度）、压力等的影响，且鱼的种类、遗传背景、生长发育和性别都会对肠道微生物产生一定影响，因此其肠道微生物结构和陆生动物相比具有更大的多样性和复杂性[2,3]，这给研究鱼类肠道微生物带来了很大的挑战。尽管如此，国内外学者通过对鱼类肠道微生物的初步研究，取得了较好的进展。

1 鱼类肠道微生物组成

鱼类肠道可能是微生物最密集的微生态系统，但是基于二代测序技术和生物信息学分析，研究者发现其生物多样性相对较低，主要有变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌（Actinobacteria）、梭状芽胞杆菌（Clostridia）、杆菌（Bacilli）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。其中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门在不同的鱼类中都几乎占90%以上。这些微生物在不同鱼类中都有相似发现，表明变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门对宿主肠道功能有重要影响和作用。因此，Roeseiers等提出了“核心菌群”（core gut microbiota）的概念，尽管这个概念最初用于哺乳动物，但是学者发现“核心菌群”同样适用于硬骨鱼类，“核心菌群”可以有效调控肠道微生物结构组成，促进鱼类健康生长。

2 影响肠道微生物的因素

2.1 食物对于肠道菌群的影响

食物（食性）在很大程度上影响肠道菌群结构。Carmody等[4]对五种不同的近交系小鼠和超过200只远交群小鼠以及转基因小鼠研究观察，发现相比于宿主基因型，食物（饮食）对个体肠道菌群改变起到更为重要作用。Romero等认为食物和水环境对幼鱼阶段肠道微生物的定植起到重要的作用，并最终决定了成鱼肠道内相对稳定的菌群结构。李可俊等[5]在对长江口8种野生鱼类的肠道菌群的比较中，发现鱼类肠道菌群多样性的差异与鱼类的食性相关，且食性差异大的鱼类之间肠道菌群差异也更为明显。

早在上世纪90年代，有研究者对6种鱼包括肠道等组织的微生物类群和数量进行观察发现，发现腐屑食性鱼类（detritivorous fish）比滤食性鱼类（filter-feeding fish）的微生物种类多，且肠道内的微生物种类和数量多于其他组织。浮游生物食性鱼类（planktivorous fish）肠道微生物种类最多，其次是杂食性鱼类（omnivorous fish）和草食性鱼类（herbivorous fish），微生物种类最少的是肉食性鱼类（carnivorous fish）[6]。

同一种鱼摄食不同食物后，其消化道微生物群落结构也会发生改变。Apper等用小麦水解蛋白作为部分食物饲喂亚洲鲈鱼（Lates calcarifer），发现其肠粘膜上微生物链球菌（Streptococcussp.）、魏斯菌（Weissella confusa，Weissellasp.）、不动杆菌（Acinetobactersp.）、棒杆菌（Corynebacteriumsp.）、明串珠菌（Leuconostocsp.）、葡萄球菌（Staphylococcus epidermis）和金黄杆菌（Chryseobacteriumsp.）的丰度显著高于用鱼粉或仅用动植物蛋白喂养的鱼，同时提高了喂养效率，并且发现后肠的吸收表面积也会改善肠道菌群[7]，表明饲料（食物）对肠道微生物类群有很大影响。

2.2 压力对肠道微生物影响

Olsen等通过研究压力（力竭性运动）和营养状态（饥饿处理）对大西洋鳕鱼（Gadus morhua）肠道微生物的影响，发现压力状态下肠粘膜在短时间通透性增加，后肠腔的微生物数量会显著增加，一段时间后恢复到正常状态。饥饿处理对于大西洋鳕鱼肠道微生物的影响小于大马哈鱼（Salmo salar），但长时间饥饿会造成不可逆转的影响。

Xia等学者对亚洲鲈鱼进行饥饿处理，发现饥饿会造成鱼肠道内菌群结构发生变化[8]。正常状态下变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌（Bacteroidetes）是3种最为丰富的种类，然而在饥饿情况下，拟杆菌门和β-变形菌门（Betaproteobacteria）迅速增加，最为丰富以适应饥饿状态。同时微生物的一些同源功能基因以及抗生素相关的基因在饥饿压力下也都有显著的不同，与抗生素相关的基因显著富集以应对饥饿状态，宿主与免疫相关的基因也普遍上调。Conway等发现饥饿会导致比目鱼（Pseudopleuronectessp.）肠道微生物细胞体积减小以适应压力环境，维持其生存。在对柔鱼（Loligo sp.）的研究中发现类似的结果。以上结果表明内外界压力对鱼类肠道微生物菌群种类、肠道菌群生物学特征以及免疫系统都有较大影响。

2.3 不同发育阶段对肠道微生物的影响

Moran等认为鱼类肠道菌群结构与宿主的个体发育程度密切相关。早在2003年，Verner-jeffreys等在对大西洋比目鱼（Hippoglossus hippoglossus）的研究中发现，其肠道菌群在仔鱼卵黄囊阶段以假单胞菌（Pseudoalteromonas）为主，而在开口仔鱼阶段则以弧菌（Vibrio anguillarum）为主。美国学者Bates等发现，斑马鱼胚胎和仔鱼发育过程中，气单胞菌属（Aeromonas）和假单胞菌（Pseudomonas）在肠道微生物中占主导地位。

Yan等[9]以斑马鱼为研究对象，通过对斑马鱼从胚胎发育到性成熟发育过程中肠道微生物群落研究，发现斑马鱼肠道微生物的组成及物种丰富度的演替指数较低，而且主要随时间发生变化，其肠道微生物群落的演替同时受生态位和随机因素的影响。该课题组后续通过比较分析我国重要养殖鱼类草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）和南方大口鲶（Silurus meridionalis）从孵化到成鱼的发育过程中肠道微生物群落构建和演替，发现同种鱼类在不同发育阶段从环境中选择特定微生物种类构建具有显著差异的核心类群和群落。该研究表明鱼类肠道微生物群落并非由环境微生物随机迁入形成，而是受肠道环境及宿主发育状态和遗传特征等决定性因素的影响。

2.4 环境对肠道微生物的影响

鱼类肠道微生物的数量和群落结构与宿主自身及其生境都密切相关。宿主对肠道微生物的影响在国内外均有报道，研究发现处于不同生长环境中的斑马鱼，肠道都存在一个核心菌群，而生活在同一水环境中的三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）、草鱼（Ctenopharyngodon idella）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）、银鲫 (Carassius auratusgibelio)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)和鳊鱼（Parabramis pekinensis）等水生生物肠道微生物群落都具有明显的物种特异性和菌群结构差异[10]。

水环境和季节等变化都会引起肠道微生物菌群的改变。Romero等发现水环境对银大马哈鱼幼鱼阶段肠道微生物的定植有重要影响，Leamaster等[11]研究发现红罗非鱼在水温18℃时肠道内微生物的数量要多于26℃时肠道内微生物的数量。王瑞旋等[12]在对军曹鱼（Rachycentron canadum）肠道微生物菌群结构研究中发现，水环境的种群多样性、群落组成及水质因子等因素和生态系统的平衡直接影响肠道微生态系统中菌群结构。Yoshimizu等研究表明，鱼类肠道微生物的群落结构具有季节性差异，微生物数量在夏季最多，在冬季最少。这些研究结果表明鱼类生长的水环境等对鱼肠道微生物的结构有重要影响。

李存玉等[13]发现池塘和工厂化养殖牙鲆（Paralichthys olivaceus）的肠道菌群结构也有很大不同，两种养殖条件下牙鲆肠道菌群结构与饵料、养殖水环境密切相关，表明不同养殖环境对肠道微生物也有重要的影响。

3 肠道微生物对宿主的影响

鱼肠道中微生物主要是互利共生存在，肠道内的微生物同宿主的肠道环境相互作用，肠道细菌利用自身的酶系分解消化肠道内大分子物质，一部分用于自身繁殖，一部分被宿主吸收。宿主利用各种防御机制将细菌的种类和数量控制在一定的水平，以保证机体的健康生长。

先前学者对高等脊椎动物肠道微生物的研究发现，其对宿主的营养代谢和免疫调节等方面均发挥着重要作用。目前有关鱼类肠道微生物的功能研究还比较少，近来随着无菌斑马鱼培养成功，研究者可以精确定植水生动物肠道内微生物，为鱼类肠道微生物功能的解析奠定了基础。

鱼类肠道微生物对宿主营养代谢的影响研究主要集中在斑马鱼，Semova等荧光标记脂肪酸类似物培养无菌斑马鱼，发现肠道微生物可以促进斑马鱼肠道上皮及肝脏对饲料脂肪酸的获取和细胞内脂滴的形成。Rawls等[14]发现在饥饿状态下，一些与脂代谢相关的基因在无菌斑马鱼体内表达量上调，表现出类似于正常动物处于饥饿时的生理状态。肠道微生物同样也会影响蛋白质代谢，无菌斑马鱼肠道末端不能吸收蛋白质大分子，表明肠道微生物在斑马鱼的脂类代谢、蛋白质代谢等过程中发挥着重要作用。

在鱼类机体营养发育、消化吸收过程中，肠道微生物也发挥着重要作用。肠道菌群的分泌代谢产物中含有多种酶，能够帮助宿主分解食物中的有机物，增强宿主对营养物质的消化吸收。黄光祥等[15]对南海底层鱼突额鹦嘴鱼（Scarus ovifrons）肠道的产酶微生物研究发现，其主要微生物参与产蛋白酶与淀粉酶，以促进鱼体对饵料的消化吸收。Bates等发现无菌培养的斑马鱼会出现一些生理异常，如肠道上皮细胞分化出现障碍，肠道缺乏刷状缘碱性磷酸酶活性，糖复合物表达谱尚不成熟，杯状细胞和肠内分泌细胞数量较少等，表明肠道微生物在协助肠道食物消化、营养吸收等方面有重要作用。

肠道微生物对于机体免疫也有重要影响。肠道内有些细菌能够分泌抗生素类物质，可阻止病原微生物侵入宿主体内。由于无菌斑马鱼存活时间不到4周，而斑马鱼获得性免疫要4周以后才能得以体现，因此在无菌斑马鱼中研究肠道微生物对宿主免疫机制的影响主要集中在先天性免疫。一些脊椎动物常见的免疫组分如血清淀粉样蛋白A1，细胞因子抑制因子3，补体3，C反应蛋白等同源基因在无菌斑马鱼中表达量降低，当无菌斑马鱼肠道定植适当的微生物后，这些基因的表达上调[14]，表明肠道微生物在宿主免疫系统发育和成熟过程中发挥着重要作用。肠道微生物在一定程度上也能反映机体的健康状态。吴金凤等[16]在研究中发现，肠道菌群对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）健康状态有指示作用，放线菌（Actinobacteria）、黄杆菌（Flavobacterium）和芽孢杆菌（Bacillus）等有益菌的丰度在发病对虾肠道中显著降低，而梭状芽孢杆菌（Clostridia）和脱硫弧菌（Desulfovibrionales）在发病对虾肠道显著增加，且发病对虾肠道细菌群落多样性显著低于健康对虾。

近年来，益生菌（Probiotics）和益生元（prebiotics）也逐渐应用于水产动物饲料。聂国兴[17]等在罗非鱼饲料中添加了木聚糖酶（xylanase），发现可以改善肠道形态结构，显著提高尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道有益菌数量，降低致病菌数量比例，并提高罗非鱼抗细菌感染的能力。张梁[18]等在饲料中添加2.5%以下范围光合细菌的饲料喂养草鱼,能够显著提高免疫相关酶活力。Liu等[19]利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）饲喂鲶鱼，其生长指标、固有免疫性能和疾病防御能力与对照组相比均有明显提高。这些结果表明益生菌/益生元作为鱼类饲料添加剂，可以促进鱼类生长，提高鱼类免疫力。

4 肠道微生物研究方法及展望

先前学者对肠道微生物的研究，大体经历了3个阶段：培养依赖的方法、非培养依赖的传统分子生物学方法和基于高通量测序的组学方法。培养法在处理复杂样本时难以进行分离纯培养，有一定的局限性。分子生物学的方法主要有如变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、末端片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，TRFLP）等指纹图谱技术，方法操作简单，但相对通量较低，成本较高。随着高通量测序的发展，宏基因组（metagenomic）测序和16S r RNA测序逐渐成为肠道微生物研究的主流方法。通过高通量测序可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量，研究肠道微生物菌种丰度变化。在对肠道微生物测序数据的生物信息学分析时，目前主要按照群落结构整体分析——分类单位差异检验——分类单位的变化与宿主其他生理指标变化的相关性分析——关键分类单位的功能验证依次进行分析，不同研究者可能有所差异。

肠道微生物在鱼类机体免疫和生长发育过程中都发挥着重要的作用，对于鱼类肠道微生物的研究，不仅仅是研究微生物的组成，重要的是研究肠道微生物及微生态系统对宿主的影响、微生物调控宿主机体的分子机制，开发海洋微生物，产生抗肿瘤、抗菌等活性物质，以及通过对鱼类肠道微生物群落结构进行研究，为开发饲料添加剂提供科学依据，指导合理使用微生物制剂等。目前关于鱼类肠道微生物还有许多科学问题没有解决，如怎样区分鱼本身的微生物和临时性的微生物，临时性的微生物可能在鱼周围的水膜或者混合在水或者食物存在于肠道中；在鱼病治理中，改变食物可以使病鱼恢复健康，因食物改变引起鱼类肠道微生物菌群组成发生变化，但这些微生物变化是如何影响鱼肠道而发挥作用不得而知。

随着宏基因组学（metagenomics）概念的提出，各种宏组学技术如宏转录组学（metatranscriptomics）、宏蛋白质组学（metaproteomics）、宏代谢组学（metabolomics)）将会越来越多地在鱼类肠道微生物研究中得以应用和发展。通过新技术方法的应用，对鱼类肠道微生物群落的遗传特性、生理生化功能基本特征进行了解，将为鱼类等水生动物病害的防治以及生态健康养殖提供理论支撑，推动水产养殖业的可持续发展。

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Research progress on the fish intestinal microbiota

Zhai Wan-ying1,2，Guo An-ning1,2

(1 Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Shanghai Ocean University,Ministry of Education,Shanghai 201306, China;2 College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The intestinal tract is inhabited by trillions of bacteria,which have an important influence on host growth and development.As an important vertebrate,fish lives in the aquatic environment,the intestinal microbiota was easily influenced by food,environment,stress and the development of host,it can also affect the nutrition, growth,reproduction and immunity of the host fish.This paper summarized the recent progress in the research of fish intestinal bacteria,including the factors influencing the fish gut microbiome,and the effect of fish intestinal microbiota.This review aimed to provide theoretic guidance for fish and aquatic animal disease control,ecological and healthy breeding to promote the sustainable development of aquaculture.

fish;intestinal microbiota;core gut microbiota;host

国家自然科学基金（31572611），上海市水产高峰学科（A12035160001B3）

翟万营（1985-），男，汉族，河南巩义人，助理工程师，研究方向：鱼类肠道微生物

翟万营，E-mail:wyzhai@shou.edu.cn