农作物转基因商业化应用及检测方法综述

陈　晓　王朝阳　赵　能　周新保　宋新莉　韩赞平

（1河南省种子管理站，郑州450002；2河南科技大学，洛阳471023）

农作物转基因商业化应用及检测方法综述

陈晓1王朝阳2赵能2周新保1宋新莉1韩赞平2

（1河南省种子管理站，郑州450002；2河南科技大学，洛阳471023）

我国在玉米、水稻等主要农作物转基因研究方面取得了较大的进展。农作物转基因监管需要高效、准确的检测技术；而我国农作物转基因快速检测技术尚不成熟。本文总结了当前农作物转基因检测的相关技术，为快速高效的转基因检测技术研究提供参考。

农作物；转基因；检测

1　转基因农作物发展的基本情况

农作物转基因技术使农作物获得自身不具有的抗除草剂、抗病虫害、耐盐碱、富营养、抗干旱、高产量、抗重金属等特性［1］，该技术自问世以来取得了飞速的发展。1988年M.A.W.Hinchee等［2］和D.E.McCabe等［3］率先获得转基因大豆植株，标志着大豆转基因研究的成功。转基因大豆商业化自1994年开始，截止到2009年，大豆已成为世界上种植面积最大的转基因作物。自C.James［4］首次利用农杆菌介导玉米转化成功以来，由于抗虫、抗除草剂玉米较好的性状表现，在美国等国家获得较大面积的推广，并为相关种子企业带来丰厚的利润回报，迄今玉米已经成为最成功的商业化转基因农作物。全球转基因植物的种植面积由1996年的260万hm2迅速增至2014年的1.815亿hm2［5］。目前，全球主要的商业化转基因作物大约有25种，其中大豆种植面积约占全球转基因种植作物面积的47%［6］，其次是玉米，约占32%，紧跟其后的是棉花和油菜，分别占比15%和5%。

2　我国农作物转基因现状

全球转基因农作物商业化种植已有20余年。我国农作物转基因技术发展也很快，到20世纪90年代中期，我国已掌握自主研究的转基因抗虫棉育种技术，并拥有相关专利，打破了国外在转基因技术上的垄断地位。自国家“十二五”规划转基因重大专项实施以来，随着技术和设备的不断更新，我国科学家在玉米、水稻等作物学领域进行了大量的研究，特别是转基因水稻方面的研究，走在世界前列，在许多方面取得较理想的发展成果。2009年12月，农业部批准了2个抗虫转基因水稻品种（华恢1号、Bt汕优63）和1个转植酸酶基因玉米品种的安全证书。

3　 转基因检测技术是转基因农作物有序发展的保障

随着转基因作物在全球范围内种植面积的日益扩大，人们对转基因安全性的关注及担忧日益增加［7］。我国对农作物转基因监管严格，行政执法部门对农作物转基因的监管，应以检测为技术依据来加大执法力度，防范非法转基因扩散对我国农业生产及食品加工行业造成危害。另外，有关转基因知识产权保护中，对于侵权的认定，也需要通过检测来确认。因此，当前形势下，加强农作物转基因检测，是确保我国农业安全、维护法律尊严的要求。加快大批量农作物种子盲样转基因检测技术研究，已成为转基因农作物商业化推广进程的重要内容。

4　农作物转基因成分的检测方法

本文综述的农作物转基因检测方法主要有3类：第1类方法在市场监管检测中最为常用，是以外源基因的特定DNA序列为对象的检测技术；第2类是蛋白质检测技术；第3类是红外检测转基因产品化学性质及空间构型。

4.1基于DNA序列的检测方法

4.1.1PCR检测方法依据其检测对象不同分为4类：元件特异性PCR［7］、基因特异性PCR［8］、构建特异性PCR［9］、转化体特异性PCR［10］。通过PCR技术检测转基因转化载体携带的启动子、标记基因、终止子等特定序列，判断其是否为转基因作物。该方法特异性较好、效率较高、费用低，是目前我国农业转基因监管部门进行转基因监管检测的主要方法，目前已发布此类检测标准逾50项。该方法通过普通PCR或实时荧光定量PCR对转基因作物通用元件进行检测，是一种较快速、高效的方法，但缺陷是目前通量较小、周期较长，容易出现假阳性。

4.1.2基因芯片法基因芯片法又称为DNA微探针阵列法，其实质就是高度集成化的反向斑点杂交技术，通过将外源基因的特异性片断制成检测芯片，与待测样本的DNA进行杂交，反应结果扫描后，通过计算机软件分析，来判断出待测样品是否为转基因产品［11］。该方法通量高，但是试验过程繁琐，尤其是费用很高，对实验设备要求高，可普及性较低。

4.2基于表达产物蛋白质的检测方法以抗体、抗原为基础的免疫学蛋白质检测方法［12］，通过定性、定量外源基因表达产生的蛋白质来判断作物是否为转基因产品。外源表达蛋白的检测方法有3种：生化反应检测法；免疫学检测法，主要有Western杂交、ELISA法及免疫沉淀法；外源表达蛋白生物学活性的检测。外源表达蛋白的检测是转基因作物检测及安全性评价最有效的方法之一，但此种方法只针对某一个转化事件，需要采取逐个排除的方法来达到检测目的，繁琐、成本高，不适于大批量盲样检测。此外还要考虑转基因后基因表达沉默的问题，易出现漏检。

4.2.1蛋白印迹法该方法利用特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品着色，通过着色的位置和着色深度，来获知特定蛋白质在目标样品中的表达情况，再通过电泳图谱分析，可定性及定量目标蛋白。

4.2.2ELISA法阳性表达蛋白的抗体与被检测样品中的转基因蛋白结合，再与酶标抗体或酶标二抗结合，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色深浅或酶标仪检测结果进行判断。

4.2.3试纸条法所谓的试纸条法，就是利用外源表达蛋白特异结合的抗体与显色剂结合后被固定在试纸条内，试纸条浸入含有外源蛋白的植物组织液中，当特异抗体与外源蛋白结合时，会呈现出特定的颜色，从而进行判断。目前，一张试纸条只能检测一种外源基因，而农作物种子尤其是玉米样品的盲样检测，可能会多到20多种转化事件，而且大部分转化事件的试纸条还没有研发成功，因此，此类方法更适合转基因科学研究中已知基因的阳性检测，还不适宜于市场监管中的大批量盲样检测。

4.2.4蛋白芯片法蛋白芯片法与基因芯片法原理类似，可以定性定量检测目标蛋白。用不同的探针阵列测定外源基因的表达产物，弥补了基因芯片检测技术的不足。该技术对设备和技术要求较高，不具备普遍性。

4.3利用红外线检测转基因产品近红外光谱法（NIR）是一种利用波长在780～2526nm范围内的透射光及反射光谱，对研究对象进行定性和定量分析的新技术，在食品、烟草、制药等转基因作物检测方面有所应用。该技术绿色、无损、快速、高效，适合在线分析［13］。

5　讨论

随着转基因农作物商业化进程的不断推进，外源基因的种类不断增加，越来越多的转基因农作物将会逐步进入市场，转基因技术的飞速发展，也要求转基因农作物的检测技术进行不断升级与改进。

目前国内外常用的转基因检测技术主要基于蛋白质和核酸水平的检测。结合国内外研究进展，可以得出：蛋白质水平上的检测主要适用于转基因初产品检测。其次，由于普通PCR和实时荧光定量PCR对通用元件进行检测是一种快速、高效的转基因检测技术，因此成为我国目前转基因作物核酸水平检测上最为主要的方法，但是还需继续提高准确率、检测通量和效率，满足日益增长的转基因样品检测需求。因此，为了更有效地应对未来转基因作物检测带来的新挑战，需要不断探索、创新和综合应用其他相关检测方法，以求更加准确、高效地做好转基因农作物相关检测工作，保障我国农业和食品安全。

［1］叶兴国，王艳丽，丁文静．主要农作物转基因研究现状和展望．中国生物工程杂志，2006，26（5）：93-100

［2］Hinchee M A W，Connor-Ward D V，Newell C A，et al．Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer．Nat Biotechnol，1988，6（8）：915-922

［3］McCabe D E，Swain W F，Martinell B J．Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration．Nat Biotechnol，1988，6（8）：923-926

［4］James C．Global status of commercialized Biotech，GM Crops：2009，Isaaa Briefs，2006，25（4）：1-2

［5］郭三堆，王远，孙国清，等．中国转基因棉花研发应用二十年．中国农业科学，2015，48（17）：3372-3387

［6］王新桐．转基因棉花中新霉素磷酸转移酶（NPTII）双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立．泰安：山东农业大学，2014

［7］郑新利，陈书田．农作物转基因技术研究进展及存在问题．中国种业，2009（3）：14-15

［8］Matsuoka T，Kuribara H，Takubo K，et al．Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modified maize（Zea mays）．Agric Food Chem，2002，50（7）：2100-2109

［9］Grohmann L，Brünen-Nieweler C，Nemeth A，et al．Collaborative trial validation studies of real-time PCR-based GMO screening methods for detection of the bar gene and the ctp2-cp4esps construct．Agric Food Chem，2009，57（19）：8913-8920

［10］Shrestha H K，Hwu K K，Wang S J，et al．Simultaneous detection of eight genetically modified maize lines using a combination of event-and construct-specific multiplex-PCR technique．Agric Food Chem，2008，56 （19）：8962-8968

［11］Liu J，Guo J，Zhang H，et al．Development and in-house validation of the event-specific polymerase chain reaction detection methods for genetically modified soybean MON89788 based on the cloned integration flanking sequence．Agric Food Chem，2009，57（22）：10524-10530

［12］李少骞．转基因植物外源基因的检测方法及整合位点的研究．长沙：湖南农业大学，2002

［13］Holst-Jensen A．Testing for genetically modified organisms（GMOs）：Past，present and future perspectives．Biotechnol Adv，2009，27（6）：1071-1082

2016-03-16）

河南省重点科技攻关项目（152102110149）通信作者： 韩赞平