EB病毒动物模型的研究进展*

2016-03-27 03:24祁承林唐安洲审校
重庆医学 2016年19期
关键词:动物模型淋巴瘤转基因

王 芝,祁承林,李 恒,杜 龙 综 述,唐安洲 审校

(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,南宁 530021)



EB病毒动物模型的研究进展*

王芝,祁承林,李恒,杜龙 综述,唐安洲△审校

(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,南宁 530021)

EB病毒;动物模型;鼻咽癌

EB病毒(Epstein Barr Virus,EBV)是1964年首次从Burkitt淋巴瘤细胞中分离得到的具有嗜B淋巴细胞特性的人类疱疹病毒。该病毒在人群中的感染率高达90%,人类通常在婴幼儿时期就感染了EBV,并终身携带[1]。EBV与多种疾病关系密切,包括传染性单核细胞增多症、病毒相关性噬红细胞增多症、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、胃癌、霍奇金淋巴瘤等[2]。其中, NPC是我国华南地区常见的恶性肿瘤,由于其发生的解剖位置隐匿,具有明显的地域性,且在国际上研究相对较少,目前NPC的研究面临诸多难题。因此,构建EBV相关的动物模型对于研究EBV与NPC及其他相关疾病之间的关系,以及EBV在疾病发生、发展中所起到的作用具有重要意义。从发现EBV至今,国内外学者为建立其动物模型付出了巨大的努力,但成果并不理想。本文就近年来已报道的EBV动物模型进行综述,探讨目前存在的问题及未来的研究方向,以期为今后研究EBV提供资料。

1 EBV动物模型的研究进展

1.1灵长类动物模型研究表明,许多旧世界猴由于存在对疱疹病毒有交叉反应的抗体,对疱疹病毒不具感染性,EBV的宿主范围仅为人及新世界猴[包括棉顶狨猴(the cotton-top marmoset)、普通狨猴(the common marmoset)和猫头鹰猴(the owl monkey)][3]。早在20世纪80年代,陆续有学者研究了EBV对新世界猴等的感染情况。有研究通过静脉结合腹腔及皮下的方式,对8只棉顶狨猴分别接种EBV诱导的永生化淋巴细胞及EBV悬液,其中各有一半的棉顶狨猴是在免疫抑制之后被接种的[4]。结果接种EBV诱导的永生化淋巴细胞组和EBV悬液组分别有1/4和3/4的动物被诱导出淋巴瘤。值得一提的是,成瘤的4只动物中有3只接受了免疫抑制剂,并且其中2只诱导出多种肿瘤。这些在免疫抑制状态下的棉顶狨猴感染EBV后均产生了一系列的免疫反应,包括一些不明显的感染和一些明显的肿瘤形成,这一现象与免疫系统削弱的人类在EBV感染后被诱导出相关疾病极为相似。Niedobitek等[5]建立了EBV持续性感染棉顶狨猴的模型,并最终发展为淋巴瘤。Cleary等[6]用高滴度的EBV悬液接种棉顶狨猴,结果诱导出多种淋巴瘤,包括淋巴系母细胞肿瘤及浆细胞肿瘤,并用多种方法检测出这些肿瘤包含了EBV基因、表达了EBV所有的潜伏性蛋白,这与EBVⅢ型潜伏性感染极其相似。EBV诱导的恶性肿瘤通常是致命的,但由于机体的T淋巴细胞免疫应答,其诱导的感染性损伤则多是可逆的,这些实验中EBV诱导的淋巴瘤在严重免疫削弱人群所患恶性淋巴组织增生相关研究中有着重要价值。普通狨猴也曾作为研究EBV的动物模型,有研究者成功建立了EBV持续感染普通狨猴的动物模型,遗憾的是,仅在狨猴体内检测到不典型的传染性单核细胞增多及相关的抗体的变化,未能诱导出淋巴瘤[7]。

1.2严重联合免疫缺失(severe combined immune-deficiency,SCID)小鼠模型1988年,Mosier等[8]在体外利用EBV的病毒悬液感染人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyts,huPBLs)建立淋巴系母细胞(lymphoblastoid cell lines,LCLs),后接种至SCID小鼠腹腔以对其进行人类免疫功能的重建,构建了人源性SCID小鼠(hu-PBL-SCID mice)模型,成功地观察到B淋巴细胞组织增生及淋巴瘤。国内外陆续有学者在研究中同样证实了这一结果[9-11]。有研究证明大多数外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyts,PBL)可在免疫重建的SCID小鼠体内存活2~4周,然后自然死亡[12]。有学者将EBV阳性胃癌细胞移植到SCID小鼠身上,成功诱导出EBV相关胃癌模型[13]。在EBV潜伏基因表达模式等方面,移植胃癌和原胃癌细胞完全一致, 可以作为研究这种特殊类型胃癌的动物模型。另有研究通过建立EBV感染的SCID小鼠模型,证实在小鼠的肿瘤细胞中能检测出EBV核抗原Ⅰ(EBV encoded nuclear antigen-1,EBNA-1)的mRNA表达,提示EBNA-1可能是临床EBV相关肿瘤的治疗靶点[14]。最近,有研究通过建立SCID小鼠诱发淋巴瘤动物模型,检测到潜伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)的表达上调,推测其可能是EBV主要的致病因子,在淋巴细胞发生恶性转化的过程中可能发挥了重要作用[15]。Ma等[16]通过接种CD34+细胞对SCID小鼠进行免疫重建,后接种EBV的病毒悬液建立动物模型,证明了EBV早期裂解蛋白对于淋巴瘤产生的作用。Chijioke等[17]通过建立SCID小鼠感染EBV模型,证明了人类自然杀伤细胞(human natural killer cells,NK细胞)可以抑制EBV裂解性感染,进而降低传染性单核细胞增多症及淋巴瘤的发生。Hartlage等[18]通过建立hu-PBL-SCID小鼠模型,研究了EBV相关裂解蛋白(BamH Ⅰ Z left fragment 1,BZLF1)有可能成为研发EBV疫苗的靶向抗原,这项研究对于EBV疫苗及相关疾病的预防控制有着重要的价值。

1.3转基因动物模型转基因动物是指用人工的方法将致病基因与启动子连接后通过显微注射、逆转录病毒载体、胚胎干细胞、精子载体等技术导入宿主动物体内,使之整合到宿主基因组而稳定表达,并具有遗传功能的一类动物。

目前,EBV转基因动物模型大多局限于针对EBNA-1或潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)等单个基因而建立的。有研究通过连接EBNA-1基因与免疫球蛋白基因启动子Eμ制备转基因小鼠,成功地在这些小鼠身上发现了淋巴瘤[19]。这一团队还曾用同样的方法制备Eμ与LMP1基因连接的转基因小鼠,但除口腔黏膜白斑的上皮增生性病变外,未见其他异常,且小鼠大部分在发育期死亡,未能检测到肿瘤的发生,但这项研究证明了LMP1可以激活多种关键因子并促进新生血管的形成及炎性反应,更进一步地证实了淋巴细胞缺陷能削弱LMP1的促炎性反应及致癌作用。这一研究探索了EBV相关恶性肿瘤及其主要致癌因子,也为治疗和干预EBV相关疾病打下了基础[20]。有研究者通过构建含金属硫蛋白基因-1(metallothionein-1,MT-l)调控区和LMP基因的pBR322-MT-LMP质粒, 用显微注射法将MT-LMP转基因接种于小鼠受精卵内制备转基因小鼠的动物模型,构建了携带LMP基因的转基因动物,成功率为8%[21]。有学者通过获得带有CMV启动子的EBV膜抗原(membrane antigen,MA)片段,采用显微注射法将其注入小鼠受精卵的雄性原核中,制备了携带LMP1(BLLF1)基因的转基因小鼠, 并用各种检测方法分析了BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达及MA在细胞中的表达部位[22-23],为深入研究EBV感染与自身免疫病的关系提供了有利的动物模型。有研究通过连接免疫球蛋白中的重链启动子和增强子与LMP1基因,成功构建了转基因小鼠并检测到B淋巴细胞瘤的发生,致瘤率高达42%[24]。此外,研究者对这批转基因小鼠进行EBV相关基因检测,发现只有LMP1表达水平较高,由此证明了LMP1蛋白对于EBV致瘤的作用极其关键,是具有致瘤作用的蛋白质。有学者构建了表达EBV潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)的转基因小鼠, 表明LMP2A可以提供B淋巴细胞受体阴性的B淋巴细胞存活信号, 并发现LMP2A对于淋巴瘤的发生也至关重要[25]。有研究利用ED-L2是存在于EBV基因组内部嗜鳞状上皮的相对特异启动子这一特性,构建了周期素D1(Cyclin-D1)的转基因小鼠, 结果在口腔、食管、前胃等部位的鳞状上皮发现了异常增生[26],并导致细胞周期、表皮生长因子受体、p53蛋白活性的异常[27]。有研究者构建了ED-L2、PLUNC-P双启动子调控NPC来源的LMP1表达载体,采用受精卵前核显微注射法构建转基因小鼠,获得了58只转基因鼠,其中4只整合阳性,并发现1只转基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位有外源基因的表达,但在鼻咽上皮细胞未发现明显的病理改变[28]。有学者采用免疫球蛋白基因启动子构建了可以表达人补体受体Ⅱ型基因(CR2)的转基因小鼠,在这些转基因小鼠体内发现了外周血B淋巴细胞被EBV感染,说明EBV确实可以通过人CR2进入B淋巴细胞[29]。有研究采用SV40启动子与EBV核抗原2(EBV encoded nuclear antigen-2,EBNA-2)基因连接构建了转基因小鼠模型,在这些动物体内检测到EBNA-2的表达,并观察到肾小管增生性病变, 继而发展到肾腺癌[30]。冯湘玲等[31]将ED-L2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)注射入爪蟾受精卵制备了转基因蛙,研究了EBV中启动子ED-L2启动GFP在爪蟾早期胚胎中的表达情况,为研究和判断启动子在体内的组织特异性提供了一种有效的方法。最近,Chang等[32]通过连接C57BL/6启动子与LMP2A基因,制备出LMP2A的转基因小鼠,发现表达LMP2A基因的小鼠脑脊髓炎症较不表达的小鼠加重且发生率更高,说明LMP2A可以提高抗原提呈功能,促进炎症的发生、发展。此外,还研究了LMP1和LMP2A是否可以在转基因小鼠体内共表达,以及LMP2A是否可以对LMP1的功能进行调节。这一研究证实,在体外LMP1可以上调B淋巴细胞活化因子并促进其增生,而LMP2A的共表达可以修复B淋巴细胞,表明LMP2A可能通过调控肿瘤坏死因子受体相关因子2A(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2A,TRAF2A)来调节B淋巴细胞的功能[33]。黄海城[34]通过连接NPC来源的LMP1(N-LMP1)和CR2,分别利用泛表达启动子CMV和嗜鳞状上皮启动子ED-L2,筛选出整合了N-LMP1和CR2双基因的细胞系,将其与卵母细胞融合,通过电激活和化学激活后,将产生的重构胚移植到受体母猪的子宫内,受孕3个月后共生产出16头小猪,其中转基因阳性猪6头,但这6头阳性克隆猪均在2周内死亡,未能检测RNA和蛋白质水平是否表达,分别解剖出舌、喉咽、会厌等部位,苏木精-伊红(HE)没有发现组织形态有异常,究其原因可能与猪存活的时间太短有关。这项研究虽未能达到预期的效果,但已经将NPC的相关基因运用到除转基因小鼠以外的动物模型上,进行了有意义的尝试,同时也为以后构建猪NPC模型提供了一些有价值的参考资料。

1.4兔子、豚鼠EBV动物模型有学者通过口腔接种B95-8细胞的细胞悬液入健康大白兔体内,虽然在接种之后2 h内观察到抗EBV衣壳抗原(viral capsid antigen,VCA)-IgG及EA-DR IgG水平升高,但由于未能检测到其他感染迹象,也未见任何肿瘤的发生,尚不能认为这些兔子被EBV的病毒悬液成功感染[35]。有研究通过对7只健康兔子进行静脉注射接种EBV的病毒悬液,结果在其中6只日本大白兔血清中检测到抗EBV相关抗体水平的升高;5只外周血中检测到EBV DNA的存在;组织病理学检查发现其中2只兔子的脾脏及淋巴组织中的一些淋巴细胞表达了EBV编码的小RNA1(EBV-encoded small RNA1,EBER1)及EBV相关蛋白,且这些淋巴细胞主要为B淋巴细胞[36]。这一研究表明,EBV可以通过静脉接种的方式感染兔子,但由于EBV与NPC关系密切,建立鼻腔或口腔接种EBV的动物模型对研究EBV及其致病机制显然更为必要。该团队也通过鼻腔结合口腔的方式对大白兔接种EBV的病毒悬液,结果与之前相似,10只兔子中有4只在接种后成功感染了EBV,在外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs)中检测到EBV拷贝数升高及相关基因mRNA的表达,还检测出相关抗体水平的升高。病理学检查发现,其中1只兔子脾脏及淋巴组织中的淋巴结表达了EBER1、LMP1及EBNA-2[37]。之后,该团队又通过培养人EBV阳性的B淋巴瘤细胞(P3HR-1)获得EBNA-2缺失的EBV,分别通过静脉注射(n=4)及鼻腔接种(n=8)的方式感染兔子,结果仅2只兔子PBMCs中检测到EBV DNA的存在及相关基因的表达。进而将这一结果与前期研究结果[36-37]比较,证明从B95-8细胞中获得的标准EBV对兔子的感染率[91%(10/11 )]比EBNA-2缺失的EBV高[17%(2/12)]。这一研究首次通过建立自然感染EBV的动物模型,阐明了EBNA-2在其感染机体中的作用[38],具有重要的指导意义。Rajcáni 等[39]通过鼻腔结合口腔的方式对兔子接种EBV,结果显示感染了EBV的兔子体内相关抗体Zta/BZLF1 IgG、早期抗原(EA)抗体IgG、及VCA IgG水平均有上升,但EBNA-1 IgG水平始终未上升,并且也未能出现传染性单核细胞增多症的表现。由此说明,EBNA-1在被感染的兔子体内缺失,并且兔子感染EBV与人类感染EBV所导致的机体反应不同。Khan等[40]通过静脉注射的方式对6只美国大白兔接种EBV的病毒悬液,结果6只兔子血清中都检测到抗EBV相关抗体IgG及IgM水平的升高,而PBMCs中EBV DNA只是短暂的被检测到;接种EBV 10周后,对这6只兔子进行持续15 d的环孢素A(每日20 mg/kg)肌内注射以进行免疫抑制,在免疫抑制后,仍然存活的4只兔子PBMCs中很容易地检测到EBV DNA的存在及相关基因的表达,并观察到EBV拷贝数明显升高。对所有4只兔子进行大体解剖及病理学检查,发现其中3只兔子出现脾脏肿大,且在这3只兔子的脾脏及肝脏中均能检测到EBER1、LMP1、EBNA-1及EBNA-2的表达。这一研究再次证实了兔子对EBV的易感性,也表明被感染的淋巴细胞在免疫抑制的状态下能够增殖。以上研究分别通过不同的方式接种EBV,静脉接种较口腔或鼻腔接种感染率更高,免疫抑制则能增加感染率,但无论是何种方式接种EBV的兔子模型,均未能检测到任何EBV相关恶性肿瘤或淋巴组织的增生。刘国超等[41]分别通过静脉接种及鼻腔结合口腔接种EBV悬液的方式感染20只豚鼠建立动物模型,结果两种感染方式均出现抗EBV相关抗体VCA-IgG及EBNA-IgG水平的升高;鼻腔滴鼻结合口腔接种的10只豚鼠有6只检测到EBV相关基因的表达,而静脉接种的10只豚鼠均未见相关基因的表达;解剖豚鼠的腮腺、肺、脾脏、肝脏等器官组织进行病理切片分析结果显示,鼻腔结合口腔的10只豚鼠中有5只发生不同程度的病变,包括肺间质水肿、炎性细胞浸润等,而静脉接种的10只豚鼠中仅1只出现轻微的肝组织炎性细胞浸润。该学者首次应用豚鼠作为研究EBV的动物模型,尽管未能诱导出EBV相关肿瘤,也为研究EBV感染、预防及治疗其相关疾病提供了基础。

2 小结与展望

综上所述,国内外现有的EBV动物模型包括灵长类、SCID小鼠、转基因动物,以及兔子和豚鼠4大类,这些动物模型在研究EBV感染、致病机制及预防治疗等方面有重要作用,但也存在着一些弊端。以往的实验中,新世界猴作为最接近人类的EBV动物模型,虽然已经取得了一定的成果,但是其作为EBV动物模型也具有局限性,因为这些动物都未能通过正常的口咽接种感染EBV,或即使感染后也未能在体内病毒的持续存在下诱导出淋巴瘤。再加上新世界猴物种濒临灭绝,极其珍贵,以及保护政策、伦理学的要求限制了其在EBV动物模型中的继续使用,导致自20世纪90年代后EBV新世界猴动物模型的研究停滞不前。SCID小鼠动物模型为EBV的研究提供了良好平台,尤其在研究EBV对机体免疫系统的影响方面有着重要的意义,但其为严重免疫缺陷个体,并不适合研究免疫系统正常个体EBV的感染及致病机制。而转基因动物模型的优点表现为这类动物模型能够靶向研究单个易感基因,对研究EBV的致病机制起到不可替代的作用,但直到目前,建立的EBV转基因动物模型无一例外的是针对局部致病机制及单个易感基因,不能模拟人的整体感染环境,这对研究由多种基因相互作用而致病的人类疾病是远远不够的。而兔子和豚鼠的模型虽然是EBV自然感染的动物模型,但其感染效果比较差,且作为低等哺乳类动物,与人类同源性相差甚远。虽能在分子细胞层次上对研究EBV提供极大帮助,但在研究人类特有的疾病方面,仍然有着不容忽视的缺陷。未来对于EBV的研究,如能在兔子及豚鼠自然感染EBV的基础上使用非人灵长类动物,将在整体水平上具有不可替代的优势。因此,建立一种在遗传特征、生理解剖及病毒感染特性等方面与灵长类甚至人类之间相似性更高的动物模型,成为近年来研究EBV及其相关疾病的迫切要求。在现有的研究基础上,建立一种非人灵长类的EBV动物模型,将为研究EBV感染人体的机制、致病机制,以及预防与治疗相关疾病打下坚实的基础。

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·综述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.040

,E-mail:anzhoutang@126.com。

广西科技厅广西自然科学基金资助项目(11-31-03)。作者简介:王芝(1989-),在读硕士研究生,主要从事EB病毒动物模型的构建研究。

R373

A

1671-8348(2016)19-2709-04

2016-01-08

2016-02-22)

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