贮藏温度和贮藏时间对北细辛花粉活力的影响研究

王志清，张舒娜，于营，邢丽伟，马琳，张亚玉

(中国农业科学院特产研究所，长春?130112)

北细辛[AsarumheterotropoidesFr.schmidtvar.maudshuricum(Maxim) kitag.]又名辽细辛、细参、烟袋锅花。以根入药，味辛，性温，归心、肺、肾经，具有祛风散寒、通窍止痛、温肺化饮之功效，用于风寒感冒、头痛、牙痛、风湿痹痛、痰饮喘咳等疾病的治疗[1]。《中国药典》将其收载为正品。细辛除了在临床上应用外，化工上常用于日用品、香精、杀虫剂、绿色农药等产品的开发，具有重要的应用价值。在细辛及其有效成分的深度开发推动下，细辛的需求日益增长。细辛在东北地区的大面积种植，既促进了东北地区农业多元化，也增加了农民收入。目前，细辛种植户的种源均为野生驯化种，是基于不同类型和遗传差异较大[2]的种质混杂群体。不同种质资源间的有效成分含量存在差异，这为选育细辛优良品种及良种杂交提供了理论依据。

北细辛开花期，花被刚裂开时，12枚雄蕊分2轮向柱头聚合，首轮6枚雄蕊全部聚集到柱头间隙后，第2轮的6枚雄蕊才向柱头下方聚合(图1)(与李媛2011报道的相似[3])，遂完成授粉过程。这一过程需要2d～4d，而在人工授粉时，也应当依照此规律，采取分时段二次授粉法。因此，在北细辛杂交育种过程中，花粉活力的保持对杂交的成功尤为重要。本试验就北细辛花粉贮藏温度和时间对花粉活力的影响进行研究。

图1 北细辛雄蕊位置变化过程及柱头授粉

1 材料与方法

1.1 实验材料

北细辛花粉采自中国农业科学院特产研究所北细辛种质资源基地(44.04′N、126.05′E)的6年生北细辛。

1.2 花粉活力测定

天气晴朗的10∶00，采集花药饱满且未散粉(初花期至盛花初期)的花粉，将花粉连同花药一起收集，置于硫酸纸上，干燥器中干燥10h。将花粉连同花药一起收集，分别装入冻存管中，分别于4℃、15℃、20℃、25℃、28℃条件下贮藏花粉，检测不同贮藏天数的花粉活力变化。

用TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)法测定花粉活力[4]。随机取5朵北细辛花，将花粉撒在载玻片上，滴加2滴～3滴0.5% TTC溶液，再滴加2滴磷酸缓冲液，盖上盖玻片，将载玻片置于内有湿滤纸的培养皿中，25℃暗培养1h，显微镜下观察载玻片中的6个视野中的花粉数量，3次重复。花粉活力=着色花粉数/观察花粉数量×100。

1.3 数据分析

利用SAS 9.1.3统计分析软件对数据进行处理，检验相关变量间是否存在显著性差异，用Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度下北细辛花粉活力随贮藏时间变化的趋势

不同温度下花粉活力随贮藏时间的变化趋势如图2所示。在5种不同温度下，贮藏2d的花粉活力保持在70%以上。但在25℃、28℃温度下，随着贮藏时间的延长，花粉活力下降速率较快。4℃和15℃条件下，2d～7d花粉活力变化曲线较缓。在4℃条件下，2d～7d花粉活力基本保持不变。在15℃条件下，花粉活力随贮藏时间延长而降低，但降低幅度较小。20℃、25℃和28℃条件下，随着贮藏时间的延长，花粉活力快速降低，20℃和25℃条件下，贮藏7d的花粉活力低于50%。28℃贮藏7d，花粉活力急剧下降，活力低于10%。

图2 不同温度下花粉活力随贮藏时间变化趋势

2.2 相同贮藏时间、不同贮藏温度下北细辛花粉活力比较

相同贮藏时间、不同贮藏温度下花粉活力差异性比较见表1。北细辛花粉在5种不同温度下贮藏2d，活力保持在70%以上。28℃贮藏2d，花粉活力明显低于其它4种温度条件下的花粉活力(P<0.05)。15℃贮藏2d，活力明显高于其它4种温度条件下的花粉活力(P<0.05)。但15℃、20℃和25℃贮藏2d的花粉活力差异不显著(P>0.05)。

花粉在5种不同温度下贮藏3d，4℃和15℃条件下的花粉活力差异不显著(P>0.05)，花粉活力保持在80%以上，20℃、25℃和28℃条件下的花粉活力差异不显著(P>0.05)。花粉在5种不同温度下贮藏7d后，花粉活力范围在5.645%～79.93%之间，差异显著(P<0.05)。4℃条件下贮藏花粉2d～7d，花粉活力由80.57%降低至79.93%，降幅较小。15℃条件下贮藏花粉2d～7d，花粉活力由85.93%下降至66.56%，其它3个温度条件下贮藏花粉7d，花粉活力低于50%。特别是28℃下，花粉活力降低至5.64%。

表1不同贮藏温度，相同贮藏时间花粉活力差异

Table 1The difference between pollen vitality stored in different temperature and time

注：大写字母表示在0.05水平上显著。

Note:Different capital letter indicating significance at the 0.05 level.

3 讨论

花粉是有性繁殖植物遗传物质的载体，是影响有性繁殖植物授粉胚胎发育的遗传基础[5]。在育种过程中，为了进行人工辅助授粉或杂交授粉，或为了解决亲本的花期不一致或远缘杂交的困难，常需要保存花粉的活力。研究花粉贮藏温度以及生活力是育种工作必不可少的基础性工作[6]。依据北细辛开花习性及柱头授粉过程可知，若实现北细辛人工授粉，必须实行花粉贮藏。在本研究中，设定了5个温度梯度进行北细辛花粉贮藏，4℃贮藏花粉7d，花粉活力依然保持在80%左右，说明4℃保存比常温保存更有效地延长北细辛花粉活力，北细辛花粉这一特点与新疆野苹果等相似[7]，也与北细辛种子贮藏特点十分相似[8]。因此，若花粉需要保持5d以上，4℃是最佳的花粉贮藏温度。15℃条件下贮藏3d，花粉活力可保持在86%左右，与桂花花粉常温贮藏3d时的活力极强非常相似[9]。因此，需要短期授粉时，建议在15℃条件下贮藏花粉。贮藏温度高于25℃时，北细辛花粉活力迅速下降，这种温度不能进行花粉贮藏。这一特点与北细辛种子活力与萌发特性非常相似。

很多研究表明，如果想实现花粉特别是桂花等[10]一些特异珍稀资源的花粉长期贮藏，一般都选择超低温贮藏。本研究是首次进行贮藏温度对北细辛花粉活力影响的研究，也旨在指导田间成功进行北细辛杂交育种。而北细辛花粉是否适合超低温贮藏有待进一步研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[K].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2]王志清,刘继勇,李昌禹,等.利用ISSR和SRAP标记分析细辛资源遗传多样性与亲缘关系[J].植物遗传资源学报,2015,16(5):1035-1044.

[3]李媛.北细辛(Asarumheterotropoides)生殖生物学的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2011.

[4]于营,郭靖,王志清,等.白花桔梗与紫花桔梗传粉生物学特性比较研究[J].特产研究,2014,36(1):39-43.

[5]张磊,李桂荣,娄腾雪,等.不同处理对丰花月季花粉生活力的影响[J].北方园艺,2015，(16):72-75.

[6]李桂荣,杨鹏鸣.硼酸与蔗糖对百合花粉生活力的影响[J].安徽农业科学,2010,38(18):9494-9495.

[7]杨磊,廖康,许正,等.新疆野苹果花粉活力的研究初报[J].中国农学通报,2009,25(23):335-338.

[8]王志清.北细辛种子特性及光合生理研究[D].北京:中国农业科学院研究生院,2011.

[9]张洪伟,段一凡,李稚,等.不同贮藏方法对桂花花粉活力影响的研究[J].南京林业大学学报:自然科学版,2014,38(S1):6-12.

[10]张亚利,尚晓倩,刘燕,等.花粉超低温保存研究进展[J].北京林业大学学报,2006,28(4):139-147.