肝癌HSV-TK/GCV自杀基因治疗的研究进展*

田海飞 综述，曾　燕 审校

(重庆医科大学附属第二医院放射科　400010)



·综述·

肝癌HSV-TK/GCV自杀基因治疗的研究进展*

田海飞 综述，曾燕△审校

(重庆医科大学附属第二医院放射科400010)

肝肿瘤；基因疗法；基因,转基因,自杀；单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷

GCV是一种用于抗病毒感染的药物，HSV-TK基因表达的胸苷激酶能将GCV磷酸化成GCV-TP取代DNA合成过程中的鸟嘌呤-5′-三磷酸，成为DNA合成的竞争性抑制剂，抑制 DNA链延长，通过诱导凋亡机制引起细胞死亡[1]。其诱导细胞凋亡的机制还与激活P53通路、线粒体损伤、细胞毒作用等相关。HSV-TK/GCV系统介导细胞毒作用中存在不可修复的双链DNA断裂，抑制基因的同源修复能够显著增强HSV-TK/GCV系统的细胞毒作用[2]。此外让转染了HSV-TK基因的细胞和TK基因阴性细胞共培养，给予GCV后不仅HSV-TK基因阳性细胞死亡，TK基因阴性细胞也发生死亡，这种现象为旁观者效应。旁观者效应的产生机制与细胞间存在物质交换相关,其中最重要的机制是细胞缝隙连接，一些对细胞缝隙连接形成起促进作用的药物如丹参酮ⅡA等可以使旁观者效应明显增强[3]。HSV-TK/GCV系统通过直接杀细胞作用和旁观者效应显现出良好的抗肿瘤作用，被广泛用于各种肿瘤的治疗研究。

1　HSV-TK基因的载体

HSV-TK基因要进入肿瘤细胞正常表达产生相应的酶，需要载体协助穿透肿瘤细胞生物膜，基因载体的选择对基因治疗系统的安全和效率至关重要。

1.1病毒载体大多数病毒可通过逆转录作用将自身基因整合到宿主细胞遗传物质中进行繁殖，病毒具有高效的转染率，但是病毒载体中常常存在与病毒自身复制及表达病原性物质相关的基因，存在一些潜在的危险因素，潜在生物安全隐患是病毒载体成为HSV-TK基因载体运用于人体的主要限制因素。目前，研究较多的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒载体等，这些病毒载体都存在各自的缺陷，但随着基因重组技术应运而生的重组病毒载体又给病毒载体带来新的生机。

1.1.1腺病毒腺病毒对动物肝脏细胞有明显嗜性，而且腺病毒载体不具细胞周期性，同时腺病毒载体可以产生较高的病毒滴度，其嗜肝性、高效性、高滴度性使腺病毒载体成为肝癌HSV-TK系统的首选载体之一。腺病毒载体历经三代发展，具较高免疫原性的第一、二代腺病毒载体已被失去大部分甚至是全部腺病毒基因只保留了反向末端重复区及包装信号序列的第三代腺病毒载体取代[4]。但是腺病毒的嗜肝性能对肿瘤细胞之外正常肝脏组织细胞产生额外的严重损伤作用，因此在利用其高效性时还要限制其对正常肝细胞的毒性作用。mir122基因是含量最多的肝细胞特异性的微小RNA，具有调控基因表达的作用，研究表明在50%～70%的人原发性肝癌和肝癌细胞株系列中mir122存在显著的减少[5]，因此有学者将mir122基因的mir122T序列插入TK基因的3′非翻译区，构建了载mir122+TK基因的腺病毒载体，体外及小鼠原位肝癌模型实验表明，该载体能够有效保护HSV-TK/GCV系统对mir122高表达的正常肝细胞的杀伤作用，而不会削弱HSV-TK/GCV系统的抗肿瘤作用[6]，实现了腺病毒载体的高效和安全的统一。

1.1.2逆转录病毒逆转录病毒能将自身基因整合到宿主遗传物质中实现在宿主细胞中的持续表达，具有相对稳定性，但逆转录病毒具有细胞周期性，只显示出对处于活跃复制、分裂期细胞的感染作用，因此逆转录病毒载体的转录效率及体内病毒滴度低，这使得常规逆转录病毒载体运用受限。小鼠慢性白血病病毒MLV相关逆转录病毒在3′非翻译区含有转座子基因，该基因能够在不侵入正常细胞的情况下稳定的传播到处于不同感染周期的实体肿瘤细胞中[7]，Lai等[8]用乙型肝炎病毒增强子Ⅱ和人类肝细胞甲胎蛋白(AFP)启动子管制区替代MLV的U3区域的长末端重复序列，构建了肝癌特异性逆转录病毒载体RRV，证实这种重组逆转录病毒载体能显著提高肝癌细胞的特异性转录水平，并且具有肝癌细胞特异性。

1.2非病毒载体非病毒载体种类繁多，包括间充质干细胞、阳离子聚合物、纳米粒、肽类、细菌类和真核细胞类质粒等。就载体安全性而言，非病毒载体比病毒载体更具优势，但常规的非病毒载体缺乏组织特异性和靶向性，容易被网状内皮系统清除，具有染效率较低的缺点，新的载体材料的发现和修饰技术的运用让非病毒载体成为较病毒载体更具前景的基因载体。

1.2.1间充质干细胞间充质干细胞具有良好的迁移性及肿瘤组织趋向性，近期研究表明间充质干细胞能高效地运输治疗基因到肿瘤细胞中长期稳定地表达，是一种新的集安全高效为一体的基因载体[9]，Nouri等[10]用间充质干细胞作为4种不同自杀基因治疗系统的载体均表现出高效的转染率和杀肿瘤细胞作用，同时该研究还表明间充质干细胞还可用于评估不同自杀基因治疗系统的治疗效果，并可对自杀基因治疗的前药进行临床前的筛选。

1.2.2纳米粒载体纳米粒因其体积小，容易穿过血管内皮细胞，并且具有抗核酸酶作用而备受亲睐，同时纳米粒可根据需要连接不同分子探针及药物实现影像显像和靶向治疗等多种功能。Alqahtani等[11]用糖聚壳修饰聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒，该纳米粒表现出良好的细胞亲和性，较低的细胞毒性，并且具有抗氧化作用。如果将HSV-TK基因包裹在这种直径小于700 nm的纳米粒中，并在纳米粒上连接单克隆抗体等靶向物质，能够让载基因纳米粒具有主动寻靶功能并能轻易透过血管内皮间隙到达细胞间隙，与细胞的接触时间增长，获得更高的转染率。

2　增效策略

治疗效率较低也是限制基因治疗发展和运用的主要因素，以下策略有望提高HSV-TK/GCV系统的治疗效率。

2.1提高基因转染效率治疗基因成功转染肿瘤细胞是基因治疗的第一步，实现肿瘤细胞靶向转染、延长基因与细胞的接触时间、增加细胞膜的通透性等都是提高转染效率的有效途径。景周宏等[12]构建了肝癌细胞 GPC3 抗体的纳米分子探针，该分子探针可特异性结合肝癌细胞，达到靶向性识别效果，有效提高基因转染效率。利用纳米粒体积小、体内的循环时间长的优势，Zhang等[13]发现用二价阳离子修饰硅纳米颗粒表面后，该纳米粒不仅能与DNA结合，并且结合在颗粒上的DNA能抵抗DNA酶的酶解作用，故将硅颗粒与脂质体混合后与DNA一起转染细胞，发现用二价阳离子修饰后的纳米粒载体基因转染效率显著提高。还有实验证明超声微泡靶向爆破系统利用其空化及声孔效应，能增加细胞膜的通透性提高转染率[14]。

2.2提高基因的转录效率在自杀基因上连接肿瘤特异性的启动子、增强子等转录作用原件，增强治疗基因在肿瘤细胞中的表达，增加基因表达产物水平，提高GCV的磷酸化水平，增加细胞毒性药物浓度。Lai等[15]构建了含AFP启动子的重组质粒载体pAFP-HSVtk-IRES2-EGFP,用该重组质粒来转染肝癌HEPG2细胞，检测HSV-TK基因表达产物，数据表明AFP阳性组明显高于AFP阴性对照组。

2.3增强HSV-TK基因表达产物与GCV的敏感性和亲和力不同类型胸腺激酶基因表达的产物对GCV的磷酸化作用效率存在差异，选择对GCV更具亲和力的基因型以增加GCV的磷酸化效率，研究表明马单纯疱疹病毒4型(EHV4-TK)突变型基因较其他类型胸腺嘧啶激酶基因与GCV的亲和性更高，能优先磷酸化GCV，终止DNA的延长，增加GCV对肿瘤细胞的毒性作用[15]。

2.4融合基因肿瘤的发生、发展、转移涉及多个基因的改变，只用更全面解决肿瘤细胞基因改变引起的变化，才能取得更高效的治疗效果。利用基因重组技术将不同治疗基因连接在一起,例如双自杀基因CD-TK融合基因，自杀基因-免疫基因重组、自杀基因-抑癌基因重组等。Higashi等[16]构建了含人端粒酶逆转录增强子序列的IL-18融合HSV-TK基因的载体，用于治疗小鼠结肠癌模型，实验数据表明IL-18融合HSV-TK基因能引起特异性免疫反应，较单基因有更佳的治疗效果。

2.5增强旁观效应旁观者效应能明显增加HSV-TK/GCV系统的杀肿瘤细胞作用，增强旁观者效应，特别是远隔旁观者效应能有效抑制肿瘤的生长和远处转移，通过调节与旁观者效应作用机制相关的因素可达到增强旁观者效应。如运用促进细胞缝隙连接的药物；增加磷酸化GCV的流出效应等，此外最新研究发现辐射能诱导旁观者效应，影响辐射诱导旁观者效应的因素包括自由基、免疫系统炎症通路、表观遗传等[17]。

2.6联合治疗单纯自杀基因治疗由于转染效率较低等多方面原因效果欠佳，基因治疗联合其他治疗方式成为解决这一问题的主要方案之一。如自杀基因治疗联合放射治疗，研究表明转染了自杀基因的肿瘤细胞对放射治疗的具有更高的敏感性。Kawashita等[18]用腺病毒Flt3L配体基因疗法+Egr-TK/GCV+放射治疗、Flt3L配体基因疗法+放射治疗及以上3种治疗方式单一治疗小鼠肝癌，实验结果显示，腺病毒Flt3L配体基因疗法+Egr-TK/GCV+放射治疗具有最佳的治疗效果。自杀基因治疗联合局部高强度聚焦超声(HIFU)治疗，HIFU是应用超声波可聚焦和穿透性，短时间内使靶区组织温度达到 65～100 ℃，使靶组织造成凝固性坏死的一种新的无创性治疗肿瘤的方法，李红阳等[19]采用HSV-TK/GCV系统联合HIFU治疗裸鼠肝癌移植瘤，联合治疗组裸鼠肿瘤大小明显小于单一治疗组，联合治疗组荷瘤鼠生存时间高于单一治疗组。

2.7实时动态监控探索HSV-TK基因在细胞内的行为机制对提高HSV-TK/GCV治疗系统的安全和效率至关重要，分子影像是实现基因的运输和在细胞内功能动态变化可视化的一个强大工具。Shao等[20]利用量子点技术在TK基因和远红外荧光量子点之间构建共价键对TK基因进行标记，这个标记既不会影像量子点的远红外荧光效应，又不会影像TK基因的生物功能，实现了对HSV-TK/GCV系统在体内、体外的作用过程的实时动态的可视化追踪，并发现这种量子点不仅可以实时追踪，还能控制管理HSV-TK/GCV的效率，这为提高肝癌HSV-TK/GCV基因治疗的安全性及效率及个体化治疗提供了可视化的依据。

基因治疗将是肝癌等恶性肿瘤非手术治疗的主导方向，具有巨大研究和发展空间，要想基因治疗能够运用于临床，造福于肿瘤患者，仍有许多限制因素需要解决，首先需要研发出集安全、高效、稳定、靶向于一体的新型基因载体，不管是病毒载体还是非病毒载体，随着不断完善和改量，都有可能成为基因治疗的最佳载体。此外自杀基因联合治疗是解决单一自杀基因疗效欠佳的解决方向；而旁观者效应是一把双刃剑，如何能更好地掌控旁观者效应使之能够最大限度地杀死肿瘤细胞而更少的损伤正常细胞是需要不断探索的内容。同时一些新的治疗评价方法也需要被不断完善，为自杀基因治疗提供正确和准确的指导，相信随着研究的不断深入，肝癌的治愈指日可待。

[1]Cheng YC,Grill SP,Dutschman GE,et al.Metabolism of 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl) guanine,a new anti-herpes virus compound,in herpes simplex virus-infected cells[J].J Biol Chem,1983,258(20):12460-12464.

[2]Ladd B,O′Konek JJ,Ostruszka LJ,et al.Unrepairable DNA double-strand breaks initiate cytotoxicity with HSV-TK/ganciclovir[J].Cancer Gene Ther,2011,18(10):751-759.

[3]Xiao J,Zhang G,Qiu P,et al.Tanshinone IIA increases the bystander effect of herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy via enhanced gap junctional intercellular communication[J].PloS One,2013,8(7):e67662.

[4]Sviatchenko VA,Tarasova MV,Netesov SV,et al.Oncolytic adenoviruses in anti-cancer therapy:current status and perspectives[J].Mol Biol (Mosk),2011,46(4):556-569.

[5]Li C,Wang Y,Wang S,et al.Hepatitis B virus mRNA-mediated miR-122 inhibition upregulates PTTG1-binding protein,which promotes hepatocellular carcinoma tumor growth and cell invasion[J].J Virol,2013,87(4):2193-2205.

[6]Wang G,Dong X,Tian W,et al.Evaluation of miR-122-regulated suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma in an orthotopic mouse model[J].Chin J Cancer Res,2013,25(6):646-655.

[7]Logg CR,Tai CK,Logg A,et al.A uniquely stable replication-competent retrovirus vector achieves efficient gene delivery in vitro and in solid tumors[J].Hum Gene Ther,2001,12(8):921-932.

[8]Lai YH,Lin CC,Chen SH,et al.Tumor-specific suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma by transcriptionally targeted retroviral replicating vectors[J].Gene Ther,2015,22(2):155-162.

[9]Yang K,Xu WG,Liu YZ,et al.Study on the effect of BMSCs-EGFP-tk as mediator of HSV1-tk/GCV suicide gene therapy directed against A549 in vitro[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(9):3080-3086.

[10] Nouri FS,Wang X,Hatefi A.Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems[J].J Control Release,2015(200):179-187.

[11]Alqahtani S,Simon L,Astete CE,et al.Cellular uptake,antioxidant and antiproliferative activity of entrapped α-tocopherol and γ-tocotrienol in poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and chitosan covered PLGA nanoparticles (PLGA-Chi)[J].J Colloi Interf Sci,2015(445):243-251.

[12]景周宏,何承俊,潘万龙,等.载肝癌细胞 GPC3 抗体的纳米级脂质超声微泡制备及体外寻靶研究[J].重庆医科大学学报,2013,38(5):449-453.

[13] Zhang TY,Huang B,Yuan ZY,et al.Gene recombinant bone marrow mesenchymal stem cells as a tumor-targeted suicide gene delivery vehicle in pulmonary metastasis therapy using non-viral transfection[J].Nanomedicine,2014,10(1):257-267.

[14]Hao Y,Guo L,Abudula A,et al.Proliferation inhibition and apoptosis enhancement of human cervical cancer cells by ultrasound-targeted microbubble destruction delivered double suicide genes[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(12):5330-5335.

[15]Lai Z,Qin Q,Yu B,et al.Construction of plasmid vector pAFP-HSVtk-IRES2-EGFP and its effect on the cytotoxicity of ganciclovir to hepatocellular carcinoma[J].Chin Med J (Engl),2014,127(12):2337-2341.

[16]Higashi K,Hazama S,Araki A,et al.A novel cancer vaccine strategy with combined IL-18 and HSV-TK gene therapy driven by the hTERT promoter in a murine colorectal cancer model[J].Int J Oncol,2014,45(4):1412-1420.

[17] Najafi M,Fardid R,Hadadi G,et al.The Mechanisms of Radiation-Induced Bystander Effect[J].J Biomed Phys Eng,2014,4(4):163-172.

[18]Kawashita Y,Deb NJ,Garg M,et al.An autologous in situ tumor vaccination approach for hepatocellular carcinoma.1.Flt3 ligand gene transfer increases antitumor effects of a radio-inducible suicide gene therapy in an ectopic tumor model[J].Radiat Res,2014,182(2):191-200.

[19]李红阳,周世骥,刘长安,等.不同浓度载 HSV1-TK 基因的超声靶向微泡造影剂对 HIFU 治疗后裸鼠肝癌的影响[J].中国医科大学学报,2013,42(1):31-34.

[20]Shao D,Li J,Xiao X,et al.Real-time visualizing and tracing of HSV-TK/GCV suicide gene therapy by near-infrared fluorescent quantum dots[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(14):11082-11090.

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.038

重庆市卫生局重点项目(2013-1-021)。作者简介：田海飞(1988-),在读硕士，主要从事腹部影像学研究。△

，E-mail:751403669@qq.com。

A

1671-8348(2016)12-1697-04

2015-12-22

2016-01-19)