流感病毒动物感染模型及其应用

于志君，孙伟洋，张醒海，杨松涛，王铁成，赵永坤，高玉伟，夏咸柱



流感病毒动物感染模型及其应用

于志君，孙伟洋，张醒海，杨松涛，王铁成，赵永坤，高玉伟，夏咸柱

［摘要］流感病毒动物感染模型是研究流感病毒致病性、传播性和宿主抗病毒免疫机制的基础。目前已有多种动物用于流感病毒研究，主要包括小鼠、雪貂和猕猴等。本文介绍了目前已经建立的流感病毒动物感染模型及其应用，为流感病毒的防控工作提供借鉴。

［关键词］流感病毒；模型， 动物；感染

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.003

流感病毒属于正粘病毒科，是单股负链RNA病毒［1］。根据核衣壳蛋白和基质蛋白抗原性的差异，将流感病毒分为A、B和C型，而历史上的4次流感大流行均由A型流感病毒引发［1］。根据血凝素和神经氨酸酶抗原性的不同，A型流感病毒进一步分为18种血凝素亚型和11种神经氨酸酶亚型［2-3］。流感病毒抗原性由其2个表面糖蛋白——血凝素和神经氨酸酶决定，其中血凝素起主要作用［4-5］。流感病毒血凝素蛋白存在一些能引起宿主产生中和抗体的氨基酸位点，称为抗原决定簇，根据这些氨基酸位点空间位置的不同，将其分成4类，即抗原决定簇Ca、抗原决定簇Cb、抗原决定簇Sa和抗原决定簇Sb［6］。这些抗原决定簇上的氨基酸位点一旦发生变化，容易引起流感病毒抗原性的改变，导致其发生抗原漂移或抗原转换［4］。

由于抗原性的改变等原因，每年季节性流感在世界范围内可以造成250 000～500 000人死亡［1］。除此之外，近年来禽流感病毒跨越种属障碍感染人疫情频频发生，如1997年香港H5N1禽流感疫情和2013年人H7N9禽流感疫情［1， 7-8］。以上事实说明流感病毒对公共卫生安全构成严重威胁。利用动物感染模型来进行流感病毒致病和传播机制研究及抗流感药物和疫苗的研发，将有助于增强我们防控流感病毒的能力。

在以往的研究中，流感动物感染模型常被用于评估流感病毒对人的感染能力以及研究流感病毒致病性和跨种传播的分子机制，帮助我们理解宿主和病毒两方面因素在流感病毒适应新宿主和致病力方面的作用。此外，流感动物感染模型还能帮助我们开发新型抗流感药物和评价流感疫苗的保护效力。目前用于流感研究的动物包括小鼠、雪貂、豚鼠、猕猴、犬、猫和禽类等［9-17］。本文将结合最新的研究进展，综述目前已建立的流感病毒动物感染模型及其在流感病毒致病性、传播性及宿主抗病毒免疫机制研究、抗流感药物开发和疫苗研究等方面的应用。

1　流感病毒动物感染模型

1.1小鼠小鼠是用于评估流感感染最常用的哺乳动物感染模型。研究发现，通常在实验室使用的小鼠的呼吸道均表达SAα2，6和 SAα2，3 2种唾液酸受体，从而对人和禽流感病毒易感。然而小鼠品系不同，其受体分布也有所差别［18-19］。研究表明BALB/c小鼠的多数器官都表达SAα2，6和SAα2，3受体，包括气管、肺、小脑、脾、肝和肾，而C57BL/6J小鼠的肺中缺乏SAα2，6受体，SAα2，3则被证明存在于纤毛孔和肺泡上皮Ⅱ型细胞上［18-19］。

虽然实验室小鼠可同时表达2种受体，然而SAa2，3受体占有优势可以解释为什么人甲型流感（H1、H2和 H3）一般要经过在小鼠体内适应性传代才能有效复制［20］。一些高致病性的人流感病毒如重新拯救的1918流感病毒也能不经过适应性传代而直接感染小鼠［21］。然而，考虑到尽管小鼠存在SAa2，6受体，但大多数人流感病毒不能感染小鼠，从而可以推断仅由受体分布并不能够决定感染性。

虽然小鼠并非流感病毒的自然宿主，但是小鼠对流感病毒较为易感，多种流感毒株可以实验感染小鼠甚至引起小鼠死亡。多株人的H1N1、H3N2亚型流感病毒和禽的H5N1、H7N7、H7N9、H9N2等亚型流感病毒均可在实验条件下通过鼻内接种［（感染剂量为107鸡胚半数感染量（50％ egg infectious dose， EID50）或空斑形成单位（plaque forming units， PFU）］的方式感染小鼠［22-27］。一旦成功感染不同亚型流感病毒（包括人的H1N1 和H3N2亚型季节性流感病毒、H5N1高致病性禽流感病毒、H7N9低致病性禽流感病毒等）后，均可表现出一些相似的临床症状，如体重减轻、肺炎、弓背等［22-25］，部分流感毒株（包括一些H5N1亚型高致病性禽流感病毒和1918西班牙流感病毒等等）感染小鼠后可引起小鼠死亡［28-29］。虽然小鼠在实验条件下，可以成功感染多种亚型的流感病毒，但几乎所有流感病毒均不能在小鼠间水平传播，小鼠不是一个理想的流感病毒传播模型。

小鼠作为流感动物感染模型，有其优缺点。其优点是价格低、遗传谱系清楚和品系纯等；缺点是小鼠非流感的天然宿主，缺少人流感病毒的临床症状、多数毒株表现体温过低而非发热、不能传播病毒和感染能力依赖鼠的种类等［30］。

1.2雪貂从1933年起，雪貂用来研究流感病毒，直至今天仍然被人们认为是研究流感病毒最合适的动物。

雪貂比较易感多种人和禽流感病毒。雪貂与人在患病时的临床表现、肺功能、气道形态、呼吸道细胞种类等方面有许多相似性。与人相似，雪貂呼吸道分布SAα-2，6和SAα-2，3 受体，SAα-2，6从上呼吸道延伸到下呼吸道比如支气管，SAα-2，3受体主要分布在下呼吸道末梢呼吸道细支气管。然而，最新研究表明在雪貂体内SAα-2，6优势受体贯穿于包括下呼吸道在内的整个呼吸道［31］。

雪貂是一种较为理想的流感感染和传播模型。雪貂对大部分流感病毒均易感。雪貂通过鼻内接种方式（感染剂量107EID50或PFU）感染人H1N1、H3N2亚型和禽H5N1、H7N9、H9N2等亚型流感病毒后症状包括体重减轻、发热、嗜睡、脉搏及呼吸频率改变、感冒症状（如喷嚏、咳嗽）等［10， 32-35］，雪貂感染H5N1高致病性禽流感病毒，可能出现重症病情，导致雪貂死亡［36-37］。雪貂不但是一种良好流感病毒感染模型，还是一种良好的流感病毒传播模型。人H1N1、人H3N2亚型流感病毒、H5N1高致病性禽流感病毒、H7N9低致病性禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒均可在雪貂间通过直接接触或水平传播［38-42］。

雪貂作为流感动物感染模型，有其优缺点。其优点是唾液酸受体分布与人相似、与人类临床症状相似、与人类呼吸道病理变化相似等；缺点是实验雪貂的年龄和体积大小没有标准化、缺少特定的免疫抗体、价格较高和饲养条件较高等［30］。

1.3非人灵长类动物虽然其他动物模型价格相对低廉并且更便于使用，但是从生理学角度以及基因序列角度来讲却没有非人灵长动物那样与人更为相近。人们研究将非人灵长类动物作为流感动物模型，因为这些动物对疾病的反应比小动物更近似于人类本身。然而，从实际角度考虑，这种动物模型费用消耗较高并且难于操作，因此并不常用。各种各样的非人灵长动物，包括旧大陆猴（恒河猴和猕猴）和新大陆猴（卷尾猴）都被用作禽流感病毒的研究［30］。

与雪貂不同，病毒在非人灵长动物吸附模式与在人呼吸道具有显著的不同；猕猴感染H3N2病毒后，病毒吸附不发生在气管、支气管或者细支气管，这就可以解释为什么猕猴感染人H3N2病毒后临床症状不明显。部分非人灵长动物对季节性流感病毒的敏感性降低归因于非人灵长动物和人类的受体分布不同［31］。

非人灵长类动物是一种较为理想的流感病毒感染模型。非人灵长类动物对许多流感病毒均易感。非人灵长类动物通过鼻内接种方式（感染剂量107EID50或PFU）感染人H1N1、H3N2亚型和禽H5N1、H7N9、H9N2等亚型流感病毒后症状包括食欲或体重下降、肺炎、发热等［43-47］，感染H5N1高致病性禽流感病毒后可出现致死性感染［48-49］。几乎所有流感病毒均不能在非人灵长类动物间水平传播，非人灵长类动物不是一个理想的流感病毒传播模型。

非人灵长类动物作为流感动物感染模型，有其优缺点。其优点是在进化上与人接近、临床症状与人更相似、病理情况和病毒复制与人相似、易于采样分析和细胞凋亡反应与人相似等；缺点是非人灵长类动物的价格较高，不易于实验操作，对人流感病毒不如人敏感，临床症状与病毒、宿主种群及攻毒方式有关，唾液酸受体分布与人不一定相似等［30］。

1.4新出现的流感病毒动物感染模型除以上3种主要的流感动物感染模型外，近年来豚鼠、犬和猫等流感动物感染模型也相继建立起来并开始应用于流感病毒传播性和致病性等方面的研究［11，13-14］。

豚鼠是一种较为理想的传播模型，豚鼠对流感病毒的易感性较好。研究发现将流感病毒通过107EID50或PFU的剂量鼻内接种豚鼠，多株人H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型流感病毒均可在豚鼠间水平传播，但几乎不表现出任何明显的临床症状［42， 50-52］。

犬和猫作为流感动物模型的应用还较少。犬和猫对多种亚型流感病毒有一定的易感性。研究发现H1N1、H3N2、H5N1、H6N1和H9N2亚型禽流感病毒可以感染犬，而H1N1和H9N2亚型流感病毒可以感染猫，感染剂量一般大于107EID50或PFU［13-14， 53-56］。犬和猫感染后表现出相似的临床症状，包括发热、流鼻涕、肺炎等。犬和猫作为传播模型的研究较少。有研究发现H3N2禽源犬流感病毒可以在犬群中水平传播［57-58］。

禽类常用于评价禽流感病毒致病性和传播性。4～10周龄的SPF鸡常用于评估禽流感病毒的致病性强弱和疫苗开发，而不同种类的鸭类用于研究禽流感病毒的地理分布［59-61］。

2　动物感染模型在流感病毒研究中的应用

2.1致病性研究流感病毒小鼠感染模型目前多用于流感病毒致病性研究。Hatta等［9］报道利用H5N1小鼠感染模型发现决定H5N1高致病性的2个分子标记PB2-E627K和HA多碱性裂解位点，揭示了1997年香港H5N1流感高致病性的原因。Jiao等［62］报道发现NS1-42S能够增强H5N1病毒对小鼠的致病性，而NS1-42P则减弱病毒对小鼠的致病性，从而证明NS1-P42S是H5N1病毒哺乳动物致病性分子标记。Hensley等［63］报道发现血凝素受体亲合力调控流感病毒抗原性变异。Jagger 等［64］报道发现PA-X缺失会导致感染流感病毒的小鼠免疫应答改变，炎症反应、趋化作用及T细胞信号通路加强。Maines等［65］报道发现甲型H1N1流感病毒对小鼠具有一定的致病性，阐述了该病毒的毒力表型。

猕猴在致病表型研究中发挥着重要作用。通过猕猴模型，人们分析了甲型H1N1流感病毒、新型H7N9流感病毒和B型流感病毒在灵长类动物上的致病表型［66-68］。Zhang等［43］发现H9N2亚型禽流感病毒能够在猕猴体内有效复制。

由于犬和猫常作为宠物与人类密切接触，有作为中间宿主将动物流感病毒传染给人类的机会，因此犬和猫模型也被建立并应用于流感致病性方面的研究。Song等［57］的研究发现，犬能够实验性感染H3N2亚型禽流感病毒。Zhang［14］和Cheng等［69］的研究发现，犬和猫能够实验室感染H9N2禽流感病毒，犬能够实验性感染H6N1亚型禽流感病毒并通过粪便和口腔途径排毒。

2.2传播性研究雪貂目前多用于研究流感病毒的传播性。Tumpey等［70］报道发现2个位点决定1918年西班牙流感病毒能否在雪貂间进行水平传播，并发现SAα-2，6 Gal受体偏嗜性是流感病毒能否在哺乳动物间传播的必要条件。Herfst等［71］和Imai等［72］发现通过基因改造和雪貂连续传代，H5N1亚型禽流感病毒能获得在雪貂间水平传播的能力。Zhang等［41］发现2013年中国大陆新出现的H7N9流感病毒能够通过呼吸道飞沫的形式在雪貂间水平传播。雪貂作为评价流感病毒水平传播能力的理想模型，一直在流感病毒传播性研究中发挥重要作用。

豚鼠是近年来开发的一种用于研究流感病毒水平传播能力的动物模型。Lowen等［73］报道发现豚鼠可以作为研究人流感病毒传播能力的模型。Steel等［74］还报道PB2-E627K和PB2-D701N突变能够增强流感病毒在豚鼠间水平传播的能力。Zhang等［75］报道PB2和HA基因上的特殊分子标记有助于甲型H1N1流感病毒在豚鼠间水平传播。Gao等［76］报道发现PB2-D701N和HA-T160A是H5N1亚型禽流感病毒能够在豚鼠间水平传播的先决条件。Zhang等［11］报道H5N1和甲型H1N1流感病毒重配病毒能够在豚鼠间水平传播。随着对流感病毒传播性研究的深入，豚鼠动物模型在流感病毒研究中的作用越来越大。

2.3宿主抗病毒免疫机制研究小鼠、鸡、鸭等也被应用于宿主抗病毒免疫机制研究。Cao等［77］对感染鸡和正常鸡的脑组织进行比较蛋白质组学分析时发现，嗜神经性流感病毒感染鸡以后，脑组织中共有31种蛋白发生了表达差异。这些差异表达的蛋白分别参与细胞骨架系统的调节以及宿主细胞的大分子生物合成代谢调节等。Boon 等［78］发现高致病H5N1流感病毒对C57BL/6J和DBA/2J 2种不同小鼠的致死剂量差距在10 000倍以上，利用全基因芯片技术分析发现DBA易感小鼠炎性趋化因子CCL2和TNF-α表达量增加，同时发现了溶血性补体作为抗病性的潜在靶点。Barber等［79］研究发现鸡体内缺少RIG-I受体，而鸭体内存在RIG-I受体，在感染流感病毒后其体内RIG-I表达水平可以调高200倍，而将鸭的RIG-I基因转染进入鸡胚成纤维细胞后可以使流感病毒在细胞内的毒力降低2倍左右，各种现象说明RIG-I可能是禽类的天然抗流感病毒基因。

2.4抗流感药物筛选和疫苗研究动物模型在抗流感药物筛选和流感疫苗研究方面发挥了重要作用。Webster团队通过将与唾液酸结合的Sp2CBMTD蛋白药物通过鼻内的方式对小鼠给药，发现100 ng给药剂量可100％保护小鼠抵御H7N9的致死性感染［80］。Wu等［81］通过给小鼠注射一种名为磷脂缀合TLR7配体的小分子药物，发现该药物可有效保护被H1N1亚型流感病毒攻击的小鼠。Kong等给雪貂接种一种新型的H7N9冷适应疫苗，免疫成功后用H7N9病毒接种雪貂，结果发现新型H7N9冷适应疫苗可以保护雪貂免于水平传播的感染［82］。Uraki等［83］将一种敲除PB2基因的新型流感疫苗免疫小鼠，发现小鼠体内能产生有效的中和抗体，并可抵御甲型H1N1流感病毒A/ California/04/2009 （H1N1 pdm09）株和H5N1高致病性禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004 （H5N1）的致死性感染。以上研究成果表明，抗流感药物的筛选和疫苗研究离不开动物模型的支持，通过攻毒保护实验，可以筛选出有效的抗流感药物和有免疫保护效果的流感疫苗。

3　结　　语

近年来流感疫情频频暴发，如2009年的甲型H1N1流感［66， 84］和2013年的新型H7N9亚型流感［85-86］，给公共健康构成严重危害，给社会造成重大经济损失。然而目前我们对流感病毒的了解程度仍然有限，很多方面仍然知之甚少，因此加强对流感病毒的研究刻不容缓。流感病毒致病性、传播性和宿主抗病毒免疫一直是流感病毒研究的热点，而构建理想的动物感染模型则可以为上述研究奠定基础。

本文讨论了已被用于研究流感宿主范围和发病机制的动物模型。到目前为止，尚没有单一理想的动物模型可用于流感病毒感染研究。每一种流感病毒动物感染模型都有各自的优缺点，因此当选择动物模型时要慎重考虑不同动物感染模型的限制性条件。通过系统地研究，构建流感病毒动物感染模型，发现流感病毒致病性增强的分子标记和揭示流感病毒跨种传播和致病性变异的分子机制，将有助于提高我们对流感病毒监测和疫苗开发的能力，为新型疫苗和治疗药物的开发提供评价模型，为靶向制剂的研发提供候选靶点，同时丰富流感病毒病原生物学知识储备。

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（2015-11-20收稿 2016-01-05修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 张云辉）

［文献标志码］［中国图书资料分类号］ R373.1 A

［文章编号］1007-8134（2016）03-0133-06

*Corresponding author. YANG Song-tao， E-mail： yst62041@163.com； XIA Xian-zhu， E-mail： xiaxzh@cae.cn

［基金项目 ］国家新药创制重大专项“H7N9马血清制备”（2014ZX09102044-007）；北京协和医学院研究生创新基金项目（10023-1001-1010）

［作者单位］100021，北京协和医学院和中国医学科学院医学实验动物研究所（于志君、夏咸柱）；130062 长春，解放军军事医学科学院军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室（于志君、孙伟洋、张醒海、杨松涛、王铁成、赵永坤、高玉伟、夏咸柱）；225009 扬州，江苏省重要动物传染病防控协同创新中心（杨松涛、高玉伟、夏咸柱）

［通讯作者］杨松涛，E-mail∶ yst62041@163.com；夏咸柱，E-mail∶xiaxzh@cae.cn

Animal models of influenza and their application

YU Zhi-jun， SUN Wei-yang， ZHANG Xing-hai， YANG Song-tao*， WANG Tie-cheng， ZHAO Yong-kun， GAO Yu-wei， XIA Xian-zhu*
Institute of Laboratory Animal Sciences， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100021， China

［Abstract］Animal models of influenza are the basis for the study of the pathogenicity， transmissibility and the host antiviral immune mechanisms of influenza virus. A variety of animals including mice， ferrets and macaques， has been used for the study of influenza virus. The authors describe the animal models of influenza and their application， so as to provide reference for the prevention and control of influenza virus.

［Key words］influenza virus； models， animal； infection