垂体柄中断综合征与前动力蛋白受体2和前动力蛋白2基因突变的相关性分析

韩白玉，李乐乐，王成芷，郭清华，吕朝晖，母义明，窦京涛

1中国人民解放军总医院内分泌科，北京 100853　2中国人民解放军264医院内分泌科，太原 030001



·论著·

垂体柄中断综合征与前动力蛋白受体2和前动力蛋白2基因突变的相关性分析

韩白玉1，2，李乐乐1，王成芷1，郭清华1，吕朝晖1，母义明1，窦京涛1

1中国人民解放军总医院内分泌科，北京 1008532中国人民解放军264医院内分泌科，太原 030001

摘要：目的分析垂体柄中断综合征(PSIS)与前动力蛋白受体2(PROKR2)和前动力蛋白2(PROK2)基因突变的相关性。方法采用聚合酶链反应和基因测序方法对59例PSIS患者基因组DNA的PROKR2和PROK2基因外显子分别进行测序与突变分析。结果59例PSIS患者中，6例发现PROKR2基因突变，其中5例位于第2外显子c.991G>A，1例位于第2外显子c.1057C>T。未发现PROK2基因突变。结论PROKR2基因可能是PSIS患者的易感基因。

关键词：垂体柄中断综合征；前动力蛋白受体2；前动力蛋白2

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：37-41

垂体柄中断综合征(pituitary stalk interruption syndrome，PSIS)是指垂体柄缺如或纤细合并垂体后叶异位，下丘脑分泌的激素不能通过垂体柄输送到垂体所致的临床系列征候群[1]。症状从单一激素缺乏到全垂体功能低下轻重不一，其中以生长激素缺乏伴其他垂体前叶激素缺乏最为常见。PSIS属罕见病，发病率为0.5/100 000，发病机制尚不清楚，主流观点认为基因突变可能是该病的病因，目前已报道的基因突变仅能解释部分患者。有研究显示，前动力蛋白受体2(prokineticin receptor 2，PROKR2)和前动力蛋白2(prokineticin 2，PROK2)参与了下丘脑垂体的新生血管形成和迁移[2- 4]，PSIS可能与PROKR2和PROK2基因突变有关。本研究以中国人民解放军总医院收治的59例PSIS患者为研究对象，分析了PSIS与PROKR2和PROK2基因突变的相关性。

对象和方法

对象2001年1月至2015年1月在中国人民解放军总医院就诊，通过垂体磁共振影像学检查、垂体前叶功能评价及临床特征相符并留取DNA样本的PSIS患者59例，其中，男53例，女6例，平均年龄(20.6±5.86)岁(8～36岁)。所有患者染色体检查均与性别符合，无异常发现，均无类似家族史。本研究经中国人民解放军总医院伦理委员会批准，所使用的血液DNA标本均经患者本人和/或患者家长同意并签字。

主要试剂和仪器全血基因组DNA试剂盒购自美国Axygen Biosciences公司，多功能DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，PCR仪购自德国Sigma公司。测序工作由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成，所用测序仪器为ABI PRISM3730，测序试剂盒为BigDye terminator v3.1。

样本采集取外周静脉血3 ml，加入EDTA抗凝剂混匀后放于-80℃冻存备用。采用美国Axygen Biosciences公司全血基因组提取试剂盒提取所有研究对象的外周血白细胞微量基因组DNA，置于-80℃保存备用。

引物设计和合成采用Primer3在线引物设计软件对基因外显子上下游各100 bp序列区域分别设计上下游引物，以扩增目的片段。为保证测序的准确性，对大于1000 bp的外显子采用分段设计引物、分段测序的方法，引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列见表1。

表 1　人PROKR2、PROK2基因外显子扩增引物序列

外周血基因组DNA提取外周血室温复融后，参照Axygen Biosciences公司提供的方法提取外周血白细胞基因组DNA。

目的基因片段PCR扩增采用Biomltra梯度PCR仪对所有外周血基因组DNA标本进行目的基因片段扩增。反应体系为25 μl体系：模板DNA 2.0 μl，浓度为100 μg/μl；去离子水14 μl；上、下游引物各为 1 μl，浓度10 μmol/L；Taq DNA 聚合酶0.5 μl；dNTP 4 μl；10×PCR缓冲液 2.5 μl。

琼脂糖凝胶水平电泳PCR 扩增产物于2%琼脂糖凝胶恒压电泳，然后采用WD- 9403c型紫外透视仪观察目的条带并拍照存档。

PCR产物纯化回收采用北京百泰克生物技术有限公司的凝胶试剂盒回收与提纯PCR扩增产物，得到纯化后的目的基因PCR扩增产物。

目的片段测序纯化后的目的基因PCR扩增产物送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行测序。

测序结果判读采用Chromas 2软件对测序图进行人工判读，并利用Sequencher软件将PCR产物序列与标准序列比对，找出碱基改变的位点。标准序列选取自NCBI genebank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/)。

结果

PROKR2基因外显子扩增PROKR2第1外显子PCR扩增出大小接近750 bp的片段；第2外显子碱基数大于1000 bp，为保证测序准确性，将其设计成2段分别进行PCR扩增，扩增产物大小均介于750～500 bp之间(图1)。

PROK2外显子扩增PROK2第1、2、3外显子分别PCR扩增出大小介于500～250 bp间的片段；第4外显子碱基数大于1000 bp，为保证测序准确性，将其设计成3段分别进行PCR扩增，扩增产物大小均介于750～500 bp间(图2)。

M：DNA标记(DL2000)；1～9：例1～9

M：DNA marker(DL2000)；1- 9：Case 1- 9

图1PROKR2外显子PCR扩增产物凝胶电泳图

Fig1Electrophoresis of PROKR2 PCR products

M：DNA标记(DL2000)；1～9：例1～9

M：DNA marker(DL2000)；1- 9：Case 1- 9

图2PROK2外显子PCR扩增产物凝胶电泳图

Fig2Electrophoresis of PROK2 PCR products

PROKR2基因外显子突变59例患者中，6例检测出PROKR2 基因置换突变，其中5例突变发生在PROKR2基因第2外显子991处，“G”置换成“A”(c.991G>A)，缬氨酸置换成甲硫氨酸(p.V331M)(图3)；另1例突变也在PROKR2基因第2外显子，发生在1057处，“C”置换成“T”(c.1057C>T)，精氨酸置换成甘氨酸(p.R353G)(图4)。

PROK2基因外显子突变全部59例患者PROK2基因3个外显子均未检测到突变。

讨论

近年来随着垂体MRI的应用，PSIS的确诊已不困难。但该病病因尚不明确，一部分学者认为围产期损伤是PSIS发病的主要原因，包括臀位、肩先露、足先露、产钳助产、外伤和窒息史等。支持点是目前所有临床研究都显示PSIS患者围产期事件发生率明显高于正常，尤其臀位生产率远高于正常人群。Maghnie等[5]报道的22例PSIS患者中，81.81%有围产期事件，其中61.18%为臀先露，而正常人群臀先露比例为3.4%。Wang等[6]观察了59例PSIS患者，结果发现54例为臀先露，占91.5%。但随着对PSIS病因的深入研究，有学者提出产前因素可能是导致PSIS发病的主要原因，理由如下：(1)一部分患者出生时并无围产期事件。(2)PSIS患者男女发病率不均衡，男女比例接近10∶1。Guo等[7]观察了55例PSIS患者，其中男性48例，占87.3%。(3)PSIS患者常合并其他先天异常，部分患者有家族性表现。Simon等[8]报道，60例PSIS患者中7例(12%)有家族史，31例(52%)存在垂体外异常，包括Fanconi贫血、Pallister-Hall综合征、Currarino综合征、Stilling-Duane综合征、颅面结构畸形等。Pham等[9]报道的53例PSIS患者中26例(49%)合并畸形。由此推测产前因素可能导致了PSIS和围产期事件，基因突变可能是该病的病因，围产期事件则可能是结果而非原因。因此，调控垂体生长和分化的基因如果发生突变就有可能导致PSIS发病。

PROKR2基因定位于20p13，全基因长约12 kb，包含2个编码外显子，编码一种由384个氨基酸残基组成的，含7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体。PROK2基因定位于3p21.1，基因全长约为13.4 kb，包含4个编码外显子(包括选择性剪接外显子3)，编码由129个氨基酸残基组成的分泌型蛋白。PROKR2、PROK2参与下丘脑垂体的新生血管形成和迁移，对垂体的形成起重要作用。本研究结果显示，59例PSIS患者中，有6例检测出PROKR2基因杂合突变，其中5例位于第2外显子c.991G>A，1例位于第2外显子c.1057C>T；其余53例PSIS患者未发现突变；全部59例患者均未发现PROK2基因突变。由此推测PROKR2可能是PSIS的易感基因之一。

A.突变基因峰图，箭头表示第2外显子991处突变(c.991G>A)；B.正常峰图

A. mutant gene sequencing peak, the arrow indicates the intragenic subsititution of exon 2(c.991G>A)；B. normal gene sequencing peak

图35例PROKR2基因突变峰图

Fig3PROKR2 gene sequencing peak in 5 cases

A.突变基因峰图，箭头表示第2外显子1057处突变(c.1057C>T)；B.正常峰图

A. mutant gene sequencing peak, the arrow indicates the intragenic subsititution of exon 2(c.1057C>T)；B. normal gene sequencing peak

图41例PROKR2基因突变峰图

Fig4PROKR2 gene sequencing peak in 1 case

目前的研究在PSIS患者中还检测出POU1F1、PROP1、HESX1、LHX3、LHX4等参与垂体生长分化的基因发生突变，但检出率均不高。由此笔者推测PSIS的发生可能不是某一个基因突变导致的，有可能是影响垂体发育的信号通路中某些关键基因发生突变所致，这有待于以后的工作进一步深入研究。

参考文献

[1]Vijayanand P，Mahadevan S，Shivbalan S，et al. Pituitary stalk interruption syndrome(PSIS)[J]. Indian J Pediatr，2007，74(9)：874- 875.

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Correlation between Pituitary Stalk Interruption Syndrome and Prokineticin Receptor 2 and Prokineticin 2 Mutations

HAN Bai-yu1，2，LI Le-le1，WANG Cheng-zhi1，GUO Qing-hua1，LV Zhao-hui1，MU Yi-ming1，DOU Jing-tao1

1Department of Endocrinology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China2Department of Endocrinology，the 264th Hospital of PLA，Taiyuan 030001，China Corresponding author：DOU Jing-taoTel：010- 55499301，E-mail：jingtaodou@sohu.com

ABSTRACT：ObjectiveTo analyze the correlation between pituitary stalk interruption syndrome(PSIS) and prokineticin receptor 2(PROKR2) and prokineticin 2(RROK2) mutations. MethodsPROKR2 and RROK2 genotypes were identified by multiplex polymerase chain reaction analysis with exon-flanking primers and by automated sequencing techniques with peripheral blood DNA samples from 59 patients with PSIS. ResultsOf these 59 PSIS patients，6 showed intragenic deletions at the PROKR2 locus. Of them，5 patients exhibited intragenic subsititution of exon 2(c.991G>A)，and the remaining one patient exhibited intragenic subsititution of exon 2(c.1057C>T). No PROK2 mutation was found in these PSIS patients. ConclusionPROKR2 may be the susceptibility gene of PSIS.

Key words：pituitary stalk interruption syndrome；prokineticin receptor 2；prokineticin 2

(收稿日期：2015- 03- 18)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.007

中图分类号:R584

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)01- 0037- 05

通信作者：窦京涛电话：010- 55499301，电子邮件：jingtaodou@sohu.com

基金项目：国家自然科学基金(81370871)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81370871)；第一二位作者对本文贡献一致The first two authors contributed equally to this article