RAPD法鉴定紫花苜蓿品种的条件优化

 赵菲佚，焦成瑾，李志明，康涛涛，安建平

（天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001）



RAPD法鉴定紫花苜蓿品种的条件优化

赵菲佚，焦成瑾，李志明，康涛涛，安建平

（天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001）

摘 要：以阿尔冈金等6个地方主栽的紫花苜蓿品种为材料，对随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）法鉴定不同紫花苜蓿品种的试验条件进行了优化。结果表明，使用改良的CTAB法提取紫花苜蓿基因组DNA蛋白较少，质量较高；PCR扩增反应体系中使用1 U/μL的Taq DNA聚合酶、10 ng/μL的 DNA模板和300 μmol/L的dNTP，扩增的条带较多，且较清晰，适宜于后续RAPD法鉴定；从100条10个碱基的随机引物中筛选出S37与S140两条引物，适用于6个不同苜蓿品种的鉴定。

关键词：紫花苜蓿；DNA提取；随机扩增多态性DNA标记（RAPD）；条件优化

紫花苜蓿在我国西北地区广泛种植，有着悠久的历史和广泛的分布[1-2]，其作为豆科牧草，具有高产稳产高蛋白等特点，被称作“牧草之王”。我国苜蓿品种丰富，除了种以外，还有亚种、变种及其近缘种等[3]。长期以来，对紫花苜蓿品种的鉴定主要从其形态学[4]和生化水平[5]着手。然而，不同品种紫花苜蓿个体间的形态差异并不明显，仅依靠传统的形态特征难以识别。从遗传学角度来看，紫花苜蓿属植物属于同源4倍体，目前其全基因组仍无法全部破译。因此，快速简便的品种鉴定方法对紫花苜蓿的推广应用具有重要意义。近年来，分子水平上的随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）为紫花苜蓿品种鉴定提供了新的思路[6-8]。

RAPD是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列基因组进行多态性分析的分子技术方法，具有标记数量多、准确性和灵敏度较高、 成本较低、通用性良好，且不需要预先知道基因组序列组成等优点，被广泛应用于种质资源分析、生物种群划分、遗传相关分析、遗传图谱构建、基因定位等领域[9-13]。但该方法存在稳定性不高的缺点，而且这个缺点多数情况下是由RAPD试验条件不够优化导致的。因此，研究以阿尔冈金等6个地方主载的紫花苜蓿品种为材料，对RAPD鉴定紫花苜蓿品种的试验条件进行了优化，以期为当地紫花苜蓿品种的鉴定及选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试紫花苜蓿品种的种子均来自天水市农业科学研究所，详细信息见表1。

表1　供试紫花苜蓿品种及产地

1.2 试验方法

1.2.1 种子培养 将各品种紫花苜蓿种子用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，然后用灭菌ddH2O浸泡5 h，置于MS固体培养基中竖直培养。在光照强度7 000 Lux（光周期L︰D=16︰8），温度24℃的条件下培养2周，即可取材提取DNA。

1.2.2 DNA提取 紫花苜蓿DNA提取使用2种方法进行。常规CTAB法操作如下：（1）称0.2 g苜蓿叶片置于研钵中，加少量的石英砂，研磨；（2）先加入1 mL CTAB提取液（1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0，0.5 mol/L EDTA，pH值8.0，5 mol/L NaCl，2% CTAB）进行研磨，再加入1 mL CTAB提取液继续研磨至匀浆样，将其移至两个1.5 mL的离心管内，放入65℃水浴处理1 h；（3）取出后11 000 r /min离心10 min，上清液移入另一离心管中后加入等体积的氯仿-异戊醇（V︰V=24︰1），混合均匀，10 000 r /min离心10 min，取上层水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，4℃下10 000 r /min再次离心10 min，弃上清；（4）用75%的乙醇洗涤沉淀两次，室温干燥；（5）加入50 μL的TE（pH值8.0）充分溶解，-20℃下保存待用。改良法CTAB法在氯仿-异戊醇操作（第3步）中进行2次抽提，使用异丙醇进行DNA沉淀，其余步聚与常规CTAB法相同。

1.2.3 DNA质量检测 将已提取的DNA样品使用TE稀释一定倍数后用UV-9200型号紫外分光光度计在260 nm、280 nm处进行吸光值测定，根据OD260/ OD280的比值来判断DNA的纯度，根据OD260计算DNA的含量。此外，将DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶，5 V/cm 电场中电泳，用溴化乙锭染色检测DNA的完整性。

1.2.4 RAPD随机引物合成 设计了100条10个碱基的随机引物（上海生物工程公司），其中主要引物的编号及序列如表2所示。

表2　RAPD分析筛选引物序列

1.2.5 PCR反应体系优化 扩增反应使用20 μL反应体系，组成如下：ddH2O 14 μL，10×PCR buffer 2 μL，MgCl21.6 μL，dNTP 0.6 μL，DNA模板1 μL，引物0.3 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL。设计不同浓度的dNTP、DNA模板和Taq DNA 聚合酶对反应体系进行优化。（1）Taq DNA 聚合酶浓度：为获得RAPD法PCR扩增时最优Taq DNA聚合酶浓度，以苜蓿品种三得利的DNA为模板，以S26、S37、S58、S87、S96、S122为引物，分别用0.1、0.5和l .0 U/μL的Taq DNA聚合酶进行扩增试验。（2）模板浓度：为了确定苜蓿RAPD时DNA模板的最适浓度，以阿尔冈金（引物为S37）和得福（引物为S58）的DNA为模版，分别使用20、10和5 ng/μL的浓度进行扩增试验。（3）dNTP浓度：为筛选到RAPD法PCR扩增时dNTP的最佳浓度，以阿尔冈金（引物为S37）和得福（引物为S58）的DNA为模版，分别使用250、300和350 μmol/L的dNTP进行扩增试验。

1.2.6 PCR扩增程序 94℃ 3 min，1个循环；94℃ 1 min，38℃ 1 min，72℃ 1 min，42个循环；72℃ 5 min延伸，4℃结束扩增。PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲液中电泳，0.5 μg/mL的EB染色，紫外灯下观察结果并拍照记录。

1.2.7 RAPD扩增 利用已优化的PCR反应体系，从100条随机引物中对阿尔冈金、得福、三得利、新疆大叶、三得利、陇东苜蓿6个品种进行RAPD分析，选择可用于鉴定这6个不同苜蓿品种的引物。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对基因组DNA提取质量的影响

从表3中可以看出，常规法提取的DNA含量平均为236.3 ng/μL，OD260/OD280比值小于1.8，说明DNA的纯度较低，可能存在着蛋白污染。而改进的CTAB法提取的DNA含量平均为442.5 ng/μL，OD260/ OD280比值在1.8左右，说明改进的CTAB法提取的DNA含量高，DNA纯度较好，能够满足后续的RAPD鉴定要求。从图1中也可以看出，常规法提取的DNA条带不清晰，而改进法提取的DNA条带明显，且整齐无弥漫，但有少量拖尾现象，基本没有降解和RNA污染增。因此，后续试验均以改良的CTAB法提取苜蓿DNA。

表3　不同方法提取的苜蓿DNA质量的比较

2.2 不同反应条件对PCR扩增效果的影响

2.2.1 Taq DNA 聚合酶浓度 如图2A显示，当Taq DNA聚合酶浓度为0.1 U/μL时，S26、S87、S96、S122没有出现条带，S37只出现了一条带，S58出现的条带不明显。由图2B可知，当Taq DNA聚合酶浓度为0.5 U/μL时，S58、S87未出现条带，S26、S37仅出现了1～2条带，S96和S122出现的条带不明显。从图2C中可以看出，当Taq DNA聚合酶浓度为1.0 U/μL时，6个引物均能扩增出条带，而且条带数目较多且明显。此结果表明，在紫花苜蓿RAPD法中建议使用1.0 U/μL的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。

图1　 不同方法对DNA提取效果的影响

2.2.2 模板DNA浓度 从图3中可看出，对阿尔冈金和得幅两个品种，当DNA模版浓度为20和10 ng/ μL时，均可以扩增出条带，且条带较多，扩增片段大小相差较小；而当模板DNA浓度为5 ng/μL时，几乎无法观察到条带。因此，在紫花苜蓿RAPD法中建议使用10 ng/μL的模板DNA进行扩增。

图3　 不同浓度的模板DNA对RAPD扩增的影响

2.2.3 dNTP浓度 如图4所示，当dNTP浓度为350 μmol/L时，扩增条带较少，且条带不明显；当dNTP浓度为250 μmol/L时，阿尔冈金可扩增出较为理想的条带，但得福的扩增效果较差，所获条带较少，且缺乏主带；当dNTP浓度为300 μmol/L时，两个品种扩增的条带数目均较多，存在较为明显的主带，且条带分布均匀。因此，在紫花苜蓿RAPD法中建议使用300 μmol/L的dNTP进行扩增。

图4　 不同浓度dNTP对RAPD扩增的影响

2.3 紫花苜蓿不同品种的RAPD分析

在100条随机引物中，筛选到S37及S140引物在PCR扩增后可分别产生6种不同的带型，如图5所示，引物S37和S140均可产生可区别的6种不同PCR扩增带型，其中S37扩增6个等位位点，24个总条带，等位基因多态性率50%；S140扩增7个等位位点，19个总条带，等位基因多态率为50%；与S37相比较，S140的扩增总条带较少，但其多态性率水平一致。这说明这两条引物尽管RAPD扩增的等位基因不同，但具有较高的多态率，均可用于对苜蓿品种的鉴定。

通过对RAPD试验条件的优化，获得了稳定的RAPD扩增条带，从而在实践中可应用此方法对苜蓿品种进行鉴定。

图5　 最优条件下不同苜蓿品种的RAPD扩增带型

3 讨 论

苜蓿叶片中含有较多的蛋白质，蛋白含量高将影响后续的PCR反应，因此在基因组DNA的提取中应尽量降低蛋白的含量。改良的CTAB法通过2次氯仿-异戊醇抽提降低了基因组DNA中的蛋白含量，提高了基因组DNA的质量。

RAPD对DNA模板的含量要求不严格，在一定范围内均可得到扩增条带，但当模板DNA的浓度小于5 ng时，RAPD谱带明显减少，因此模板DNA含量过低会使引物无法识别序列，从而导致引物与模板序列无法匹配，进而影响PCR的结果。但如果DNA模板含量过高，也可能会干扰引物与模板的结合，从而在总体上降低扩增效率。试验结果表明，在苜蓿RAPD法PCR扩增中，模板DNA含量为10～20 ng时所得到的条带数目差异不大，但小于5 ng时将无法进行RAPD分析。

Taq DNA聚合酶浓度对RAPD扩增也有较大影响。试验中使用1.0 U/μL的Taq DNA聚合酶，其扩增条带要比0.1和0.5 U/μL的清晰，且条带明显增多，这说明Taq DNA聚合酶需达1.0 U/μL时才适合于DNA扩增。该研究中，使用250 μmol/L或350 μmol/L的dNTP扩增的条带较模糊，且条带较少，而使用300 μmol/L的dNTP扩增的条带较多，且较清晰。已有研究表明，dNTP与Mg2+浓度在PCR 扩增过程中紧密相关[14-15]。试验结果表明：在单一Mg2+浓度下，提高dNTP的浓度有增强条带亮度的作用，但当dNTP的浓度从300 μmol/L提升到350 μmol/L时，扩增的条带变得不明显，并且条带变少，这可能是因为：在PCR过程中需要游离的Mg2+增强DNA聚合酶的活性，而游离的Mg2+在反应中可以和dNTP中的磷酸集团进行结合，当dNTP浓度过大时与磷酸集团结合的Mg2+增多，用于增强DNA聚合酶的Mg2+减少，所以PCR反应受到影响，甚至扩增受到抑制。因此，在苜蓿RAPD分析中，dNTP浓度以300 μmol/L最为适宜。

在前述PCR最优反应体系的基础上，使用100 条10个碱基的随机引物对阿尔冈金、得福、三得利、新疆大叶、三得利、陇东苜蓿6个紫花苜蓿品种进行RAPD鉴定，结果表明：引物S37和S140在6个不同紫花苜蓿品种的RAPD分析中，均可产生较为明显的带型，条带数目多且清晰，稳定性高，等位基因多态性率达50%。这表明RAPD法可应用于不同苜蓿品种的鉴定。

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（责任编辑：成 平）

Optimization  of  RAPD  Parameters  for  Identifying  Various  Alfalfa  Varieties

ZHAO Fei-yi，JIAO Cheng-jin，LI Zhi-ming，KANG Tao-tao，AN Jian-ping（School of Bioengineering and Biotechnology, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, PRC）

Abstract：In this study, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) optimal parameters for identifying various alfalfa varieties including the extract of genomic DNA, concentration of Taq DNA polymerase, DNA template and dNTP for PCR amplification were screened. The results showed that the improved CTAB approach, 1 U/μL Taq DNA polymerase, 10 ng/μL DNA template and 300 μmol/L dNTP were pinpointed as a combination of optimal parameters for the RAPD identification of various alfalfa varieties. Subsequently, One hundred 10-mer random primers were used for this screening to distinguish various alfalfa varieties based on the optimal parameters, and the two primers, S37 and S140, were obtained to achieve the goal. The study suggested that this method would provide a new alternative strategy for identifying and breeding alfalfa varieties.

Key words：alfalfa; DNA extraction; random amplified polymorphic DNA(RAPD); parameter optimization

通讯作者：安建平

作者简介：赵菲佚（1972-），男，甘肃天水市人，副教授，主要从事植物分子生物学研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31260568，31160060）；天水市科技局2010年科技支撑计划项目

收稿日期：2015-10-16

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.01.001

中图分类号：Q94-336

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）01-0001-05