大曲检测指标研究进展

涂荣坤，钱志伟，秦　辉，杨　平，马　蓉，杨甲平，徐前景，蔡小波，敖宗华(1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）



大曲检测指标研究进展

涂荣坤1，2，钱志伟1，2，秦辉1，2，杨平1，2，马蓉1，2，杨甲平1，2，徐前景1，2，蔡小波1，2，敖宗华1，2
(1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）

摘要：目前大曲检测指标研究包括理化及生化指标、微生物指标、酶系列指标、香味物质指标等。对大曲检测指标研究现状进行了简要概述，并对大曲在食品健康与安全生产研究方面提出了展望。

关键词：大曲；检测指标；研究进展

优先数字出版时间：2015-10-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151023.1345.001.html。

大曲自古就有“酒之骨”之称，是大曲酒酿造生产中的重要物质，是酿酒生产的糖化、发酵、酒化和生香剂，含有多种微生物及其产生的多种酶类，其品质对大曲酒的出酒率和酒质都有极大的影响。随着生物学、检测技术的迅速发展，人们对传统工艺酒曲研究的深入，对大曲微生物及酶系的作用机理有了较清晰的认识，对整个发酵原理的研究也更加清晰化、条理化。这些研究成果将会有效地推动大曲生产及发酵工业化生产的合理进程[1-2]。

大曲研究检测指标包括理化及生化指标、微生物指标、酶系列指标和香味物质指标等。这些指标的检测对大曲质量标准的进一步规范化、标准化起到一定的推动作用。本课题组从已经公开的文献资料中收集、整理相关的大曲检测指标，简要介绍大曲中测定指标的研究进展[3-7]。

1大曲理化及生化指标研究进展

大曲的理化指标可归结为大曲发酵代谢的终极状态指标，不对窖内固态酿酒结果产生直接影响或影响甚微的指标，是大曲的静态指标。它主要包括传统理化指标中描述的水分、淀粉、酸度以及反映大曲发酵成熟度的曲块容重等指标[6]。

大曲生化指标即大曲生化功能的动态指标，即酒化力、酯化力和生香力等，是大曲所具备的活性指标[3-5]。

炊伟强等[8]从感官特征出发，选取泸州老窖普级大曲和优级大曲进行比较研究，以期发现感官特征与微生物、理化指标和生化性能等的关系。结果表明：优级大曲中细菌、芽孢杆菌、霉菌、酵母菌的总数高于普级大曲；理化指标分析显示，优级大曲和普级大曲相比，优级大曲中水分、酸度高，淀粉含量低；优级大曲中的液化酶、糖化酶、蛋白酶的活力均明显高于普级大曲；优级大曲的生化性能要优于普级大曲，总游离氨基酸含量方面也高于普级大曲。

任道群等[9]对泸型大曲发酵过程理化指标的变化进行研究，得出结论：以液化力的变异性最大，一般为50 %左右。其次是酸度和糖化力，为20 %～30 %，淀粉含量的变异性较小。温度的高低对糖化力影响较大，高温曲糖化力低，低温曲糖化力高，可改进制曲工艺提高糖化力，同时进一步研究高温曲赋予酒香的原因。

唐玉明等[10]以泸州老窖成品曲为研究对象，根据多元生物统计学原理，采用DPS数据处理系统，对曲药理化指标进行了基本参数估算、系统聚类分析和多元相关分析。结果表明：①泸州老窖的曲药质量基本稳定，可以95 %的置信区间作为判定曲药质量是否相对稳定的范围；②曲药可分为性能各异的3个大类，第一类曲是液化力、糖化力、酯化力和酒化力均较高；第二类曲各指标值均处于中等值；第三类曲是糖化力、液化力、酯化力和产酒力均较低；③曲药的部分理化指标间存在显著的相关性，呈正相关的有酸度与氨态氮、液化力与糖化力、液化力与发酵力、发酵力与发酵醪酸度；呈负相关的有酸度与酒化力、酸度与发酵醪总酯、糖化力与发酵力、发酵醪酸度与酒化力。曲药酸度大小和氨态氮含量高低可作为反映大曲复合曲香物质强弱的指标；④传统的体现大曲产酒能力糖化力、液化力和发酵力三大指标与大曲发酵醪的产酒量(酒化力)无明显相关性，曲药的酯化力与发酵醪酯含量相关性亦不明显，表明大曲的酒化、酯化、生香功能是一个非常复杂的系统，需要更进一步的深入研究。

张良等[11]对泸型酯化曲在发酵过程中微生物菌群和酶活指标变化趋势进行研究，揭示了微生物菌群变化与酯化曲酶活之间的关系。泸型酯化曲和中高温曲酶活指标的对比结果表明，泸型酯化曲的糖化力、酯化力和液化力均优于中高温曲，为改进泸型大曲生产工艺提供了理论依据。

张良等[12]以中高温曲作为研究对象，重点研究了曲药贮存过程中液化力、糖化力、发酵力等生化性能的变化，同时也研究了微生物种群和数量在这一过程中的变化。由生化性能以及微生物的变化，得出曲药贮存4个月后使用效果最好。

2大曲微生物指标研究进展

大曲是一种“多酶多菌”的微生态制品，进入酿酒发酵体系后，大曲中代谢酯化酶的微生物如产酒微生物一样，仍然存在一个“吸水复活、生长繁殖和微生物酶的代谢”过程。大曲的生产是靠传统工艺自然接种，它是富集、培养有益的微生物和其代谢产物的载体。大曲的微生物主要有4类：霉菌、细菌、酵母菌、放线菌。目前研究大曲微生物方法主要为：其一，利用传统方法对微生物进行分离、培养，直接镜检计数和平板菌落计数是常用的统计方法；其二，利用分子生物学的方法对大曲中主要菌种进行分子鉴定，是一种快速、简便和有效的方法。分子生物学技术的发展使微生物学研究从可培养技术转向了未培养分析法[13]。

2.1传统微生物指标研究进展

王忠彦等[14]对郎酒高温大曲中的微生物进行培养计数，发现细菌最多，霉菌次之，酵母很少。霉菌数量曲皮与曲心差异不大，曲皮比曲心略多，这是由于在制曲的高温期，部分霉菌被淘汰。

施安辉等[15]用稀释平板计数法对雁宾大曲中的细菌类群进行了剖析，并对芽孢杆菌和非芽孢杆菌在大曲中的量比关系进行了探讨。同时，也对主要产酸菌进行了分类。结果表明，芽孢杆菌在细菌总数中只占很小部分，非芽孢杆菌占细菌总数的绝大部分。大曲中细菌主要类群是乳酸菌和醋酸菌，在产酸细菌中乳酸菌数量最高。细菌优势菌种为乳酸杆菌属、醋杆菌属、芽孢杆菌属、微球菌属。

廖建民等[16]从四川泸州几个名优酒厂的曲药中分离得到125株细菌，并按照常规生理生化手段进行了分类。从初步鉴定结果看，芽孢杆菌数量多，种类也较多；球菌数量少，种类比较单一，主要是乳球菌类；无芽孢杆菌主要是醋酸杆菌和乳酸杆菌。

姚万春等[17]系统地研究了泸州老窖国窖曲不同层次间微生物数量、种类和优势种群差异及规律。结果表明：国窖曲层次间微生物数量、种类和优势种群差异较大，其中曲侧表层和曲包表层微生物数量多，以霉菌为主，微生物种类少，优势菌是根霉；曲包心、曲心、曲底表层微生物数量少，以细菌为主，优势菌是芽孢细菌，微生物(主要是细菌)种类较多；青霉和犁头霉主要分布在曲底层；黄曲霉、红曲霉、酵母菌均匀分布在曲坯各层。

杨代永等[18]对茅台高温大曲制曲发酵过程进行跟踪检测。初步分离出汉逊酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属等6种酵母；枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等41种细菌；曲霉属、毛霉属、根霉属等51种霉菌。高温大曲发酵过程中的微生物总数以细菌为主，霉菌次之，酵母最少。

王世宽等[19]研究了大曲发酵的3个阶段：培养期、堆积转化期和储存阶段，发现各个阶段中微生物及理化指标的变化均呈现一定规律。温度对微生物生长影响较大，与乳酸菌、酵母菌、霉菌和细菌的变化有较强的相关性，湿度影响程度较弱；微生物数量变化和部分理化指标呈一定的相关性，一定程度上微生物的数量变化对理化指标的影响是显著的。

总之，传统的微生物指标测定方法主要是利用微生物生长特性，采用选择性培养基将目标微生物分离培养。并根据微生物的形态、生理生化特征或遗传特征进行鉴定。但是，这种方法不仅工作量大、费时，而且在多样性研究中存在很大的局限性。自然环境生态中存在很多不能培养的微生物，该方法并不能完全反映整个微生物群落的全貌。分子生态学的研究表明，被分离的微生物仅占总微生物的1 %～5 %[20]。

2.2微生物分子生态学技术研究进展

目前，在白酒酿造微生物研究中用到的分子生物学方法主要有克隆文库、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）、实时定量PCR(qPCR)等。而核糖体基因间隔区分析(RISA)虽然在白酒发酵微生物多样性研究中还没有相关报道，但是陆健等运用RISA研究了黄酒麦曲制作过程中的真菌结构及变化，证明了该方法可以非常方便、快速的分析复杂微生物群落结构的组成，也非常适合研究微生物的动态变化，这给白酒微生物多样性的研究提供了新的选择[21-22]。

张文学等[23-24]应用DGGE（变性梯度凝胶电泳)研究了泸州老窖发酵过程中酒醅细菌和真菌群落结构变化规律。Lactobacillus acetotolerans在整个发酵过程中处于优势地位。真菌多样性随着发酵过程的进行而不断降低。

潘勤春等[25]建立了一种利用PCR-DGGE技术快速有效地评价汾酒大曲细菌群落结构多样性的方法，研究结果表明，品温最低的清茬曲含有的条带最多(10条)，后火曲次之，品温最高的红心曲含有的条带最少。清茬曲和红心曲间迁移位置不一致的条带达8条。在培养工艺中，品温控制的高低对3种汾酒大曲中细菌的种类多少和数量多少的影响较大。通过优势条带切胶鉴定，得知汾酒大曲中的细菌组成包括Enterococcus、Bacillus、Lactobacillus、Acinetobacter、Agroc-occus，其中Enterococcus 和Bacillus为优势类群。同时，还发现了5种不可培养微生物（Uncultured bacterium），丰富了酿酒微生物资源。

罗惠波等[26]通过PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)分析了浓香型大曲发酵过程中7个曲样中真核微生物群落的变化情况，在大曲发酵过程中，微生物群落结构复杂，变化多样，不同微生物群落具有协同和制约的复杂生态学效应，并与外界因素相互作用，共同对大曲发酵过程产生影响。大曲发酵过程中温度的升高，对真核微生物多样性的影响较大。

高亦豹[27]采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术，研究了5种高温和中温白酒大曲细菌群落结构，通过优势条带切胶鉴定确定了大曲中优势细菌种属信息。结果表明，Weissellacibaria、Lactobacillus helveticus、L.fermentum、L.panis等乳酸菌普遍存在于5种大曲，Thermoactinomycessanguinis仅存在于高温酱香型大曲中，同时DGGE检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcus xylosus、Klebsiella oxytoca。不同工艺大曲细菌群落结构存在明显差异，随着制曲温度的升高，大曲细菌多样性指数有下降趋势。PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地研究白酒大曲细菌群落结构的技术。

秦臻等[28]建立了一种基于生物标记物表征大曲类固态发酵体系微生物群落结构的生物化学方法。以微生物细胞膜的特征组分磷脂脂肪酸(PLFAS)组成信息为指标，描述大曲微生物群落结构特征；采用麦角甾醇标记物含量估算出样品真菌生物量。结果显示：5种不同生产工艺的大曲样品中共计检出18种磷脂脂肪酸，优势PLFAs是16：0、18：2ω6, 9和18：1ω9，占总PLFAs物质的量的90 %以上。从PLFAs组成特征判断5类大曲中优势菌群均为真菌。基于麦角甾醇含量与真菌生物量的关联性，估算出绝干大曲中的真菌生物量分布在110.45 μg/mg± 4.60 μg/mg～218.47 μg/mg±11.19 μg/mg。

黄祖新[29]利用宏基因组学技术可以直接从基因水平上研究大曲酒生产微生物群落，研究发酵过程中微生物群落的消长及变化，特别是对大曲酒微生物群落的功能菌及多酶体系的认识，全面了解大曲酒微生物群落的代谢机理和形成大曲酒与众不同的香味组分的构成和风味特征。

3大曲酶系指标研究进展

大曲中的酶根据催化功能可分为糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶等酶类。目前大曲酶类物质的研究测定主要集中在糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等能评价大曲发酵性能的指标[30-33]。

范文来等[34]对浓香型大曲的分解酶体系中的液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶测定方法作了全面的研究。研究发现，大曲不同部位的液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶含量不同，它们主要存在于曲外层；pH值对大曲水解酶活力有影响。发现液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶受pH值影响较大，而对酸性蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶活力影响较小；测定了不同等级曲的水解酶活力。一等品大曲的液化力、糖化力、酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力和木聚糖酶活力大于二等品曲，二等品曲大于三等品曲。

张艳梅等[35]在茅台酒酒糟中添加纤维素酶(10 U/g酒糟)和糖化酶(60 U/g酒糟)，于58℃水浴中保温6 h，还原糖含量增加为18.78 g/L，乳酸产量达到7.01 %左右，出酒率提高2 %左右，可提高茅台酒酒糟的再利用价值。

王耀等[36]对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传统测定方法(需反应100 h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应条件为：在30 mL正庚烷有机反应介质中，35℃的条件下，加入0.15 M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1∶1.25，加入15 g(干曲)的大曲，仅用24 h就能比较出大曲酯化力的高低。

万自然[37]研究了中温大曲培养发酵30 d左右过程中曲料内的微生物及酶系的变化规律，“前火不可过大”，若大曲培养前期升温过快、过高，微生物不能充分生长繁殖；“后火不可过小”，降温期是大曲中保留微生物及酶增长的重要时期，若温度降得太快或控制得太低，微生物不能充分生长，将严重影响大曲质量。

张秀红等[38]对清香型大曲中可能存在的淀粉代谢相关酶类及各自催化作用进行全面分析，并从Brenda数据库中搜索酿酒相关的淀粉水解酶，了解不同来源淀粉水解酶类的酶学特征，并从基因组角度分析酿酒微生物合成的淀粉代谢酶类，对酿酒微生物有更深入的认识，为选育理想的酿酒微生物提供理论依据。

张强等[39]在提取条件为料液比1∶2、pH6.0、温度30℃、提取时间2 h下，用水相制取不同大曲的酶组分溶液，并按常规方法测定其液化力、糖化力。以α-淀粉酶、糖化酶水溶液作为标样，对提取液中酶组分进行高效液相色谱（HPLC）分析，分别计算标样和提取液对应峰的峰面积，进行峰面积比较并换算为酶活。与常规方法测试结果进行比较，HPLC分析结果与常规分析结果一致。这一结果表明，HPLC适用于大曲的质量评价，HPLC的精确性和可同时分析多组分特性表明这一方法在曲药质量测定中有较好的应用前景。

4大曲香味物质指标研究进展

表1　大曲香味物质研究概况[41-46]

大曲是白酒酿造的发酵生香剂，含有丰富的白酒香味前体化合物，大曲中的香味成分种类繁多，而且组成相当复杂，同时大曲也是香味化合物的载体，就是常说的曲香，不同等级曲药的香味成分又存在着区别。目前酿酒行业技术人员已经开始全面地研究了中国白酒的香气特征，对于大曲香味物质的研究，主要采用的方法为气质联用（GC-MS），气相色谱-闻香法（GC-O）和（EN）等，气相色谱-闻香法能评价出各种挥发性物质对总体风味特征的作用，电子鼻技术的实验结果只是反映被检测的挥发性风味物质的整体信息。表1列举了利用先进检测仪器分析大曲的香味物质的研究进展[40]。

5大曲食品安全指标研究进展

随着我国经济的不断发展，食品种类越来越丰富，产品数量供给充足有余，在满足食品需求供给平衡的同时，食品质量安全问题越来越突出。从原料到白酒成品的整个生产过程都是在开放式的环境中进行，存在一定的安全隐患，大曲在其培菌发酵和入库贮存过程中微生物利用大曲中的营养成分自然发酵，可能会污染一些有害霉菌，这些霉菌可能产生真菌毒素。由于在白酒生产的蒸酒过程会破坏多数霉菌毒素，且大多数毒素不易挥发因而难以进入成品白酒，所以这些毒素被带入到成品白酒的可能性微乎其微。大曲中可能存在的生物毒素有：黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、呕吐毒素和桔霉素。

但是，作为工厂大规模生产酿造用原料的大曲在某种意义上也是食品，从防患于未然的角度，检测成品大曲中几种具有代表性的霉菌毒素的含量，进一步提高食品安全指标，提高食品安全意识[40，47]。

张春林[40]利用HPLC方法分析泸州老窖公司制曲生态园大曲中的霉菌毒素含量，选取了具有代表性、可能在小麦原料中被带入或者在培菌发酵期和入库贮存期产生的4种霉菌毒素：黄曲霉毒素B1（曲霉属产生）、赭曲霉毒素A（曲霉属和青霉属产生）、呕吐毒素（谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生）和桔霉素（青霉属和红曲菌产生）进行实验检测分析。检测结果表明，该方法具有很好的精密度和回收率，大曲中的AFB1在国家标准安全范围以内；大曲的OTA含量没有超标；大曲样品的呕吐毒素含量没有超过1000 μg/kg的国家标准；4种大曲样品均未检测有桔霉素，符合国家限量标准。因此，大曲中检测到的4种真菌毒素含量均未超过国家或国际上通用的限量标准，符合食品类商品出厂标准。因为大曲用于发酵酿酒还要经过后续工艺流程，所以大曲中的毒素通过蒸馏被最终带入到白酒成品的可能性极小。

6　展望

6.1通过工艺调整调控制曲过程生产有利于健康的香味物质

随着检测技术的发展，大曲中更多有利人体健康的物质被检测出来，通过检测出来的健康物质为代谢目标产物，利用发酵代谢调控技术调整制曲工艺以生产出优质的大曲。通过酿酒过程，有利于健康的物质被带入酒体中，适量饮酒后，更有利于促进人体健康，同时，有利于生产工艺的改进，产品质量的提升。

6.2加强食品安全卫生指标的检测

白酒生产的开放式生产，多菌种混合发酵，随着未来环境的变化，各种未知的对人体有害的物质都可能产生，因此应当加强对食品安全指标的检测，及时发现食品中的潜在危险，不断提高食品安全技术检测能力与水平，对食品中的风险危害做到未雨绸缪、预防在先。吸收借鉴外国先进检测技术，为我所用，为食品监管提供有力支撑；检测技术水平的提高，会促进食品安全国家标准的提升，也将推动食品国际贸易的发展。

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Research Progress in Daqu Detection Indexes

TU Rongkun1,2, QIAN Zhiwei1,2, QIN Hui1,2, YANG Ping1,2, MARong1,2, YANG Jiaping1,2, XU Qianjing1,2, CAI Xiaobo1,2and AO Zonghua1,2
(1.Luzhou Laojiao Co. Ltd., Luzhou, Sichuan 646000; 2.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing, Luzhou, Sichuan 646000, China)

Abstract:At present, Daqu detection indexes include physiochemical indexes, biochemical indexes, microbial indexes, enzyme series indexes and flavoring compounds indexes, etc. In this paper, the research progress in Daqu detection indexes was reviewed and the research on Daqu in the fields of food safety & health was discussed.

Key words:Daqu; detection index; research progress

通讯作者：霍丹群（1965-），女，博士，教授，博士生导师,从事微生物资源开发与利用、生物大分子的结构与功能等方面的研究。

作者简介：涂荣坤（1981-），男，四川省白酒尝评委员，研究方向：酿酒技术，E-mail：turk@lzlj.com.cn。

收稿日期：2015-08-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015332

中图分类号：TS262.3；TS261.1；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）01-0110-06