水飞蓟组织培养的研究进展

李春玲， 杨世海

(吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118)



水飞蓟组织培养的研究进展

李春玲， 杨世海*

(吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118)

对水飞蓟组织培养中外植体来源、愈伤组织诱导、再生植株诱导、毛状根诱导以及组织培养物中活性成分等方面进行了综述，以期为解决水飞蓟的资源需求以及以组织培养为基础的基因与代谢工程研究提供理论及技术指导。

水飞蓟；组织培养；愈伤组织；毛状根

水飞蓟Silybummarianum(L.)Gaertn.又名水飞雉、奶蓟、老鼠筋，为菊科水飞蓟属植物，以其干燥成熟果实入药[1-2]，原产于南欧、北非，在欧洲作为治疗肝胆疾病的民间用药已有2 000多年历史[3]。1952年，北京植物园从英国引进做观赏植物栽培，1972年由中国土产畜产进出口公司天津土产分公司从德国引种作为药用植物栽培[4]。研究发现，水飞蓟素具有较强的抗氧化功能，能保护肝脏细胞免受自由基破坏；促进蛋白质的合成，加快制造新的肝脏细胞，或使已受损的肝脏细胞自行修复。因此被称为“天然的保肝药”。除具有预防和治疗肝胆疾病外，还具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、提高免疫力等功能[5-8]。水飞蓟素已被FDA作为营养品和治疗摄入肝脏毒性的药物收录。除药用价值外，水飞蓟在油料、饲料、蜜源、观赏及食品保健等方面也有广泛应用。

水飞蓟是近几十年来国内新发展的一个药材品种，目前国内数十家制药厂用来提取水飞蓟素，主要出口德国、美国、日本，用于制药和用作食品添加剂，年需求水飞蓟原料5万t左右。国内有些药厂用以制成治疗肝病的药品如水飞蓟素胶囊、水飞蓟宾胶囊、水飞蓟宾葡甲胺片等[9]。虽然利用微生物和化学方法可以人工合成药用化合物，但其价格昂贵，有副作用[10]。人们试图通过多种手段来解决水飞蓟资源问题。药用植物组织培养技术作为中药生物工程的核心内容之一，在药用植物的资源保护和可持续发展方面具有重要作用。目前，药用植物细胞的大量培养主要用来生产药物和次生代谢物质，如抗癌药物、生物碱等。关于水飞蓟生物技术方面，国内外都有研究，但国外研究较多。药用植物的细胞培养，克服了药用植物生长缓慢、有效成分积累有限、种植季节限制等问题。笔者对近20年的水飞蓟组织培养研究进行综述, 以期为水飞蓟组织培养研究提供参考和理论指导。

1　无菌苗

研究表明，在对水飞蓟进行离体培养时，最常用的外植体材料为水飞蓟种子无菌培养后所获得的无菌苗。水飞蓟的种皮上常附有各种微生物, 其种皮内部也会产生内生菌，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋生，造成感染，培养失败，因此，培养前通常需进行消毒处理，以提高其发芽率，避免污染。无菌苗培养一般是挑选成熟饱满的水飞蓟种子，在超净工作台内用温水浸泡20～60 min后，用无菌水冲洗3次，70%～75%乙醇消毒30～60 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%～0.5%HgCl2浸泡1～7 min，无菌水冲洗5次；或者将30%左右的次氯酸钠替换HgCl2浸泡20 min。最后用灭菌滤纸将种子表面的水分吸干，接种在MS固体培养基中，置于温度(26±2)℃、光强强度2 000 lx、光照时间12 h/d的培养箱中培养7 d左右，萌发水飞蓟无菌幼苗。

2　愈伤组织诱导

在诱导水飞蓟愈伤组织时，常用水飞蓟无菌苗的叶、茎、根部作为外植体材料。生长素和细胞分裂素在水飞蓟愈伤组织诱导过程中共同起决定性作用，单一细胞分裂素不能诱导水飞蓟产生愈伤组织。因此，多以NAA、6-BA和ZT等激素混合协同作用，在25 ℃、黑暗条件下诱导愈伤组织的发生。但不同研究者对以上具体条件的报道有所差异。

傅瑜[11]研究发现，不同外植体诱导情况存在明显差异。将水飞蓟的茎、叶、根为外植体材料，接种于MS+NAA 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L和MS+ZT1 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的固体培养基上诱导愈伤组织。其中，茎的诱导率是100%，叶的诱导率是95%，根的诱导率是60%，茎的愈伤组织为乳白色，半透明，是较好的诱导愈伤的材料，叶黄绿色，表面光滑，是较好的愈伤增殖材料。

姜婷婷[12]研究认为，以B5为基本培养基，根为外植体接种后无明显的分化迹象，节部、叶片和节间在B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT培养基中可以诱导出不同程度的愈伤组织团块。其中，叶片诱导出的愈伤组织增殖最快。

姜鸿运等[13]对水飞蓟愈伤组织悬浮培养发现，培养基种类对水飞蓟细胞增长量具有明显的作用，MS培养基最有利于水飞蓟悬浮细胞增长量的大幅增加，其次为B5、N6、White。

Cacho等[14]研究发现，生长10 d的水飞蓟幼苗在pH 5.6的MS+1 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L BA固体培养基上暗培养30 d诱导出水飞蓟愈伤组织。

Rady等[15]研究发现，水飞蓟诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.25 mg/L 2,4-D+0.25 mg/L KT，愈伤组织增殖的最佳培养基为MS+0.25 mg/L BA+0.25 mg/L NAA。

Guinea等[16]研究发现，黑暗条件下在MS+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT固体培养基中能获得质地疏松的愈伤组织，也是建立细胞悬浮培养的最佳培养基。Bekheet等[17]以叶片、叶柄和茎段作为外植体，在MS培养基中添加5 mg/L KT+0.5 mg/L IAA诱导愈伤组织，以叶片为外植体诱导率最高。研究还发现，在5 mg/L KT+ 0.5 mg/L IAA + 0.1 mg/L GA3培养基中培养的愈伤组织能得到最大的生长量。Becker等[18]研究发现，用NAA和KT组合也能诱导出愈伤组织，但这些愈伤组织的存活时间不超过90 d。

在节部和节间外植体愈伤组织的诱导过程中，愈伤组织形成速度较慢，21～28 d后所形成的团块也较小。经继代培养后，生长速度明显加快。3种诱导愈伤组织培养基的诱导率由高到低依次为1/2MS、MS、改良white，节部外植体愈伤组织的诱导率高于节间外植体。ZT对 NAA与BA的综合效果可能有一定的促进作用[19]。

研究表明，水飞蓟根组织的分化程度较高，叶和茎组织分化程度较低，最易脱分化，产生愈伤组织。在诱导愈伤组织的试验中，水飞蓟叶和茎是较为理想的材料，根组织分化程度较高，脱分化产生愈伤组织困难。这说明诱导水飞蓟愈伤组织常用的基本培养基为MS。

3　毛状根诱导

1900年，Stewart等[20]第一次提出“毛状根(hairy root)”的概念。1977年，Ackermann[21]首先成功地用发根农杆菌侵染高等植物获得毛状根。直到20世纪80年代，毛状根培养体系作为基因工程和细胞工程相结合的一项技术受到越来越多的关注。目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，其中，大部分为草本植物，也有少量木本及藤本植物。水飞蓟毛状根培养体系国外研究最早，文献报道也最多。

Rahnama等[22]和Kim等[23]以胚轴、幼苗叶和子叶为外植体，在pH 5.8的MS培养基上预培养3 d。预培养后的外植体浸入发根农杆菌ATCC15834菌液侵染10 min，然后用无菌滤纸擦干，共培养3 d后，转移至含有250 mg/L头孢噻肟的MS培养基中培养28～35 d，产生水飞蓟毛状根。另一种方法是在整个苗期使用胰岛素注射器将发根农杆菌菌液注射在下胚轴。毛状根主要从外植体的切割面出现，长至4～5 cm后进行分离，在黑暗中以无激素的MS液体培养基为继代培养基，在25 ℃、摇床转速130 r/min黑暗条件下，每14 d继代一次。

Bekheet等[17]用发根农杆菌A4侵染水飞蓟子叶10 min，在28 ℃黑暗条件下，摇床转速为100 r/min的MS培养基上培养21～28 d，获得大量水飞蓟毛状根。研究表明，不同年龄段的外植体均表现出不同比例的毛状根诱导转化率，用新鲜的水飞蓟叶片为外植体诱导毛状根转化率更高。

Rahnama等[22]研究发现，用发根农杆菌AR15834接种水飞蓟下胚轴、子叶和叶片，接种7～10 d后，在外植体受伤的部位诱导出水飞蓟毛状根。其中，150个子叶外植体接种，28 d后经β-葡萄糖醛酸染色鉴定有45(30%)个水飞蓟毛状根成功诱导。水飞蓟下胚轴诱导率为7.9%，子叶为21.6%，采用注射的方法对整株水飞蓟植物体的诱导率为20%。

张淑丽[24]采用R15834、R1601、R1000、1025、A4、R1 6种发根农杆菌对水飞蓟的根、叶片、茎段3种外植体进行诱导，结果6种发根农杆菌都能够侵染并产生毛状根。发根农杆菌A4、1601、15834、R1和1025诱导率具有显著性差异(P<0.05)，其中，A4诱导率最高(84.83%)。茎段只有A4、1601、15834 3种发根农杆菌诱导产生毛状根，其中，1601的诱导率最高(20.00%)。叶片只有A4、1025和R1 3种发根农杆菌能够诱导毛状根，其中，A4诱导率最高(29.00%)。6种发根农杆菌中，A4菌株能够成功诱导水飞蓟根段、茎段、叶片3部分产生毛状根，其中，根段诱导产生的毛状根诱导率高，分枝多，证实A4发根农杆菌侵染水飞蓟根段产生毛状根为最佳方法。

利用发根农杆菌对水飞蓟的下胚轴、子叶、叶片、茎段、根进行毛状根的诱导，均能获得毛状根。国内外研究表明，大多以发根农杆菌AR15834和A4为诱导水飞蓟毛状根所用菌液。水飞蓟毛状根无论是预培养、共培养还是继代培养几乎均采用MS为基本培养基。

4　再生植株

植物体外形态受到多种因素的影响，如外植体初始类型、生长调节剂、培养条件、基因型与营养成分。导致整个植物体细胞胚胎发生、芽的形成及根的产生即获得再生植株的途径主要有2个：直接产生植物再生器官过程，没有形成愈伤组织的中间阶段；间接培养成愈伤组织，再分化成再生植株。而调节生长素和细胞分裂素之间的配比是形成不定芽和不定根最主要的方法。

Pierik[25]研究表明，6-BA对获得水飞蓟直接再生器官有很强的作用，KT和NAA配合使用能更有效地获得愈伤组织，进而形成再生植株。MS培养基中添加1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA能获得水飞蓟不定芽，2 mg/L KT+2 mg/L NAA配比可以更好地获得愈伤组织。Abbasi等[26]研究表明，将同种外植体转移至MS+2.0 mg/L GA3+1.0 mg/L NAA培养基中，30 d后获得较多数量的再生芽组织器官。John等[27]研究表明，在添加2 mg/L NAA+1.5 mg/L BA的培养基上，水飞蓟愈伤组织全部转化成不定芽。

刘四清等[28]将1 cm长的无菌苗下胚轴置于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+水解酪蛋白200 mg/L的固体培养基上诱导愈伤组织，随后转移至MS+0.8 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA的分化培养基上，分化出不定芽后将芽从愈伤组织表面切下移入MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+200 mg/L水解酪蛋白的固体培养基上诱导生根。得到的完整植株用自来水冲洗除去琼脂，并浸泡1 d，移栽至土壤中。

姜婷婷[12]研究发现，诱导不定芽最适培养基组合为B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，而诱导培养不定根的最适培养基为B5+1.0 mg/L NAA。

Bekheet等[17]研究表明，以叶片为外植体直接获得再生芽器官的最佳培养基为1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA，相同的外植体在2 mg/L KT+2 mg/L NAA的培养基上间接形成芽器官。为了进一步研究器官形成和试管苗增殖的能力，以叶片为外植体在MS培养基中添加6-BA、KT、NAA不同组合的培养基，经过35 d的培养，获得直接(芽)和间接(愈伤组织)再生器官组织。结果发现，直接和间接芽器官的形成主要取决于培养基中加入生长调节剂。培养基中含有NAA和6-BA更适合直接芽的形成。然而，KT和NAA组合是形成间接器官最合适的激素种类。在此培养基中愈伤组织培养35 d后变成绿色，显示出器官亲叶和茎形态，在1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA的培养基中直接器官发生的比例高达60%。在添加2 mg/L KT+2 mg/L NAA培养基中有50%间接器官形成。

水飞蓟再生植株我国研究较早，但文献报道较少，只有在20世纪90年代有一些研究，且研究内容不包括再生植株的水飞蓟素含量测定。水飞蓟愈伤组织诱导及再生植株分化培养基多以MS为基本培养基，也有少部分用B5培养基。

5　有效成分

Cacho等[14]对水飞蓟体外培养体系研究发现，细胞悬浮培养和愈伤组织培养中水飞蓟素积累量高于植物子叶中水飞蓟素的含量。Alikaridis等[29]对水飞蓟毛状根与未转化的植物根部进行检测和鉴定，发现未转化的根部含有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁；水飞蓟毛状根中含有异水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁。

Iqbal等[30]以叶、茎尖、茎段为外植体获得水飞蓟再生幼苗，经测定再生植株中水飞蓟宾的含量高于原植物。将试管苗移栽至土壤中，随着栽培时间和培养基成分的不同，水飞蓟宾的产量也随之变化。培养56 d后水飞蓟宾达最高积累量。

Rahnama等[22]建立水飞蓟毛状根培养的8种体系并测定了水飞蓟素各个黄酮类化合物的积累量，与未转化的根进行比较后发现，水飞蓟毛状根产生的水飞蓟宾含量为0.007 mg/g DW、异水飞蓟宾为0.011 mg/g DW、水飞蓟亭为0.041 mg/g DW、水飞蓟宁为0.042 mg/g DW和花旗松素为0.009 mg/g DW。这均明显高于水飞蓟根部含量。其中，水飞蓟素最高产量为1.000 mg/g DW。

Rady等[15]对不同基因型水飞蓟愈伤组织中水飞蓟素含量进行测定，结果表明，水飞蓟愈伤组织中水飞蓟亭含量在0.09～2.01 mg/g，水飞蓟宁为0.02～0.25 mg/g，水飞蓟宾为0.01～0.61 mg/g，总水飞蓟素最高积累量达2.1 mg/g。

Alikaridis等[29]对生长28 d的水飞蓟植物注射发根农杆菌产生的毛状根与相同生长龄的水飞蓟植物根部黄酮类化合物进行比较，发现水飞蓟植物根部主要含有的黄酮类化合物为水飞蓟宾17.9%和水飞蓟亭8.1%，水飞蓟诱导的毛状根中含量最多的黄酮类化合物为异水飞蓟宾17.7%。

Alikaridis等[29]研究结果与其他研究者有所差异，这可能是由于用HPLC洗脱时间不同有关，洗脱时间减少有可能导致单峰合并，所以水飞蓟毛状根中黄酮类化合物只检测到异水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁。

6　结语与展望

该研究对水飞蓟的组织培养进行了归纳和总结，对水飞蓟组织培养过程中外植体来源及预处理、愈伤组织诱导、再生植株诱导、毛状根诱导以及组织培养产物中活性成分4个方面进行了总结与分析。随着水飞蓟组织培养的发展，以望通过悬浮细胞培养或者毛状根培养来直接生产水飞蓟宾、水飞蓟素黄酮等活性化合物；培养再生植株，与大田栽培相结合，旨在培育出单位面积产量更高的水飞蓟品种。

目前，水飞蓟组织培养过程中仍存在许多问题，如水飞蓟毛状根和愈伤组织中生产的黄酮类化合物比水飞蓟种子中的含量低，需要寻求一种新的方法来提高毛状根中黄酮木脂素类化合物的生产水平。但随着水飞蓟组织培养的深入研究，以期这些问题能得到解决，为以后其他研究的开展奠定基础。

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Research Progress of Tissue Culture ofSilybummarianum(L.) Gaertn.

LI Chun-ling, YANG Shi-hai*

(College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118)

We summarized the explant source, callus induction, regeneration induction, hairy roots induction and active components in tissue culture ofSilybummarianum(L.) Gaertn.This research aimed to provide theoretical and technical guidance for the resource demand ofS.marianumand the genetic and metabolic engineering research based on tissue culture.

Silybummarianum(L).Gaertn.; Tissue culture; Callus; Hairy roots

吉林省科技发展计划重大项目 (20126046)。

李春玲(1990- )，女，吉林长春人，硕士研究生，研究方向：中药学。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事中药生物技术方面的研究。

2016-05-07

S 503.53

A

0517-6611(2016)17-187-03