牛奶中甲氧苄啶胶体金快速检测装置的研制

2016-03-18 16:36李晓娜李君秀杨星星李细清汪凤林严义勇

安徽农业科学 2016年7期

关键词：快速检测胶体金牛奶

李晓娜，李君秀，付辉，杨星星，李细清，汪凤林，杨中，朱海，严义勇*

(1.深圳市易瑞生物技术有限公司，广东深圳 518000；2.深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518000)

牛奶中甲氧苄啶胶体金快速检测装置的研制

李晓娜1，2，李君秀1，付辉1，杨星星1，李细清1，汪凤林1，杨中1，朱海1，严义勇1*

(1.深圳市易瑞生物技术有限公司，广东深圳 518000；2.深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518000)

摘要[目的]研究牛奶中甲氧苄啶的胶体金快速检测装置，快速筛查牛奶中甲氧苄啶添加物含量并评价牛奶品质。[方法]制备抗原，免疫得到抗体并摸索胶体金免疫层析装置的样品检测性能。[结果]试验所得装置对牛奶中甲氧苄啶的肉眼可见检测线为2 ng/L，假阳性率为0%，假阴性率为0%；与常见3种混合添加物无交叉反应，特异性高；不同批次间结果重复性高度一致；稳定性好，易于保存，在37 ℃条件可存放35 d，50 ℃存放6 d对其质量无影响；兼容性好，适合6种不同种类奶基质；检测时间短，仅需6 min。[结论]该研究的装置检测时间短，使用简单，重复性好，产品稳定性高，适用于牛奶中甲氧苄啶的现场快速筛查和检测。

关键词牛奶；甲氧苄啶；胶体金；快速检测

甲氧苄啶是一种亲脂弱碱性乙胺嘧啶类抑菌剂[1]，其抗菌谱和磺胺类药物相似，但抗菌作用较磺胺类药物强，对大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎杆菌、腐生葡萄球菌、多种革兰氏阳性和阴性细菌有效，但对绿脓杆菌感染无效，最低抑菌浓度常低于10 mg/L。甲氧苄啶单用易引起细菌耐药性，故一般不单独使用，主要与磺胺类药组成复方制剂，因此它又被称为磺胺增效剂，用于扩大抗菌谱，增强抗菌活性。临床上用于治疗尿路感染、肠道感染、呼吸道感染、菌痢、肠炎、伤寒、脑膜炎、中耳炎、流脑、败血症及软组织感染等，可与长效磺胺类药合用于耐药恶性疟的防治。随着磺胺类药物在兽医临床上不合理的使用甚至滥用，抗菌增效剂类药物在动物源性食品中的残留会不可避免地发生。人类长期食用含有甲氧苄啶残留的动物源性食品及其制品，将有可能对健康产生危害。因此为了加强对动物源性食品中此类药物的监控，建立一种准确、快速、方便的甲氧苄啶残留量检测方法很有必要。

目前，国内外检测甲氧苄啶的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱-质谱联用(LC-MASS)法和酶联免疫吸附(ELISA)法[2-4]。在食品安全检测中，往往先用ELISA初筛后再对阳性样本用HPLC或LC-MASS进行确证。上述方法中所用仪器设备复杂、成本高、对操作人员技术要求高且不能立即显示结果，不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象进行快速地在线检测和监控，因此笔者研制出一种能快速检测牛奶中甲氧苄啶的装置。

1材料与方法

1.1材料检测用牛奶样品购自当地超市。氯金酸、柠檬酸钠、甲醇等化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；卵清蛋白、牛血清蛋白购自生工集团；甲氧苄啶购自sigma公司；硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫及反应杯购自上海必泰生物科技；所用纯水为出自纯化系统的电阻为18.2 mΩ的超纯水。磁力加热搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；数控切条机、点模仪，杭州格伦坤科技有限公司；真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原制备。在100 mL的三颈瓶中依次加入2.5 g甲氧苄啶，30 mL 48%氢溴酸，100 ℃反应30 min，然后加入50%氢氧化钠溶液6 mL淬灭。冷却析出晶体后，将晶体溶解于20 mL沸水，随后加入浓氨水调节pH至7，重结晶提纯。

取上一步晶体0.5 g溶于10 mL DMF中，加入碳酸钾0.5 g，及0.43 mL溴丙酸，40 ℃反应6 h。乙酸乙酯萃取过柱提纯得甲氧苄啶半抗原。

1.2.2免疫抗原制备。利用甲氧苄啶半抗原制备免疫抗原。取甲氧苄啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，搅拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液，称取卵清蛋白(OVA)140 mg溶于10 mL浓度为0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4 ℃下反应 12 h。离心后，取上清液，4 ℃下用生理盐水透析3 d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中，冻存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.3包被抗原的制备。利用甲氧苄啶半抗原制备包被抗原。取甲氧苄啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，搅拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液，称取牛血清蛋白(BSA)140 mg溶于10 mL浓度为0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4 ℃下反应 12 h。离心后，取上清液，4 ℃下用生理盐水透析3 d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中，冻存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.4胶体金的制备。取纯水100 mL，加入1 mL 1% (m/V)的氯金酸溶液，搅拌均匀并加热至沸腾，迅速加入2.4 mL 1%(m/V)柠檬酸钠水溶液，搅拌均匀并继续加热至沸腾，至液体变为酒红色停止加热。冷却至室温，并补充水至100 mL，得到胶体金溶液。

1.2.5甲氧苄啶单克隆抗体的制备。利用甲氧苄啶免疫抗原制备单克隆抗体。使用甲氧苄啶免疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄昆明小鼠，加强免疫3次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用2倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，3 d后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8∶1的比例混合于50 mL离心管，加入30 mL无血清IPMI1640培养基，1 100 r/min离心5 min后弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37 ℃水浴中。将1 mL 50%PEG-4000缓缓加入细胞中，在1 min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1 min后，前30 s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基 1 mL，后30 s加入2 mL，然后快速加入27 mL终止融合过程，1 100 r/min离心5 min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96 孔细胞培养板中，37 ℃、体积分数5%的CO2条件下培养。7 d后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。

采用体内诱生腹水法生产抗甲氧苄啶单克隆抗体。选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油 0.5 mL/只，7 d后腹腔注射杂交瘤细胞(3～5)×106/只，10 d后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗甲氧苄啶单克隆抗体的含量。

1.2.6胶体金标记抗体。调节胶体金溶液pH至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入甲氧苄啶的单克隆抗体，1 h后加入抗体量相当的PEG，充分反应30 min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30 min。在9 000 r/min下离心30 min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。

1.2.7胶体金快速检测装置的组装。在底板上，沿同一方向依次将样品垫、喷涂有甲氧苄啶-BSA(检测线)和兔抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜及吸水纸依次搭接粘连；反应杯内加入胶体金标记抗体，冻干。装置结构如图1所示。

1.2.8检测方法。取200 μL奶样品于微孔中混匀，(40±2)℃温育3 min，插入试纸条，(40±2)℃温育3 min后进行结果判读。

1.2.9检测装置的性能测定。

1.2.9.1检测限、假阳性率、假阴性率。取阴性牛奶样本，添加甲氧苄啶标准品至浓度分别为0、1、2、3、4、5、10、15 ng/L，每个浓度重复5次，样品处理后用检测装置检测，判定检测限、假阳性率及假阴性率。

1.2.9.2特异性。取阴性牛奶样本，添加甲氧苄啶标准品至浓度为2 ng/L，其他药物添加为20 ng/L，每个浓度重复5次，样品处理后用检测装置检测，判定其特异性。

1.2.9.3重复性。分别取3个不同批次的牛奶样品，使用检测装置进行检测，判断其重复性。

1.2.9.4兼容性。分别取不同性质奶品，添加甲氧苄啶标准品浓度为0及2 ng/L，使用检测装置进行检测，判断其样品适用性。

1.2.9.5稳定性。将产品分别置于37及50 ℃环境，隔一定天数取出装置进行检测，判断其稳定性。

2结果与分析

2.1检测限、假阳性率及假阴性率检测装置浓度设置如表1所示，试验结果见图2。当添加甲基苄胺浓度为0～1ng/L时，检测线(T)颜色较对照线(C)深，结果为阴性；当添加量为2 ng/L时，T线颜色与C线相当，结果为弱阳性；当添加量为3～15 ng/L时，T线颜色远弱于C线，此时为强阳性结果。因此，该试纸条的检测限为3 ng/L，假阳性率及假阴性率均为0%。

注：“-”表示检测结果为阴性，“+”表示检测结果为阳性。