邻二甲苯高效降解菌的分离及其降解特性

陈佩，颜家保，，武文丽，胡茜茜（武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 43008；武汉科技大学教务处，湖北 武汉 43008）



邻二甲苯高效降解菌的分离及其降解特性

陈佩1，颜家保1，2，武文丽1，胡茜茜1
（1武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081；2武汉科技大学教务处，湖北 武汉 430081）

摘要：以邻二甲苯作为唯一碳源，从长期受焦化废水污染的土壤中分离得到一株能降解邻二甲苯的高效菌株LJ5，经生理生化和16S rDNA鉴定，该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。菌株LJ5适宜的降解条件为：培养温度35℃，pH=7.0～8.0，摇床转速150r/min。菌株LJ5在邻二甲苯浓度高达2500mg/L时，对其的去除率在30h内可达到73%，它对邻二甲苯的降解过程符合Monod动力学方程，当邻二甲苯浓度远远大于64.32mg/L时，LJ5降解底物速率最高，达到43.29mg/(L·h)。菌株LJ5能在实际焦化废水中很好的生长，菌液投加48h后可使COD降解率达到34.74%。

关键词：邻二甲苯；分离；降解；动力学

第一作者：陈佩（1990—），女，硕士研究生。E-mail 504532896@qq.com。联系人：颜家保，教授，博士生导师，主要研究方向为环境友好化工新技术。E-mail 972787445@qq.com。

焦化废水含有大量有毒有机物，如酚类、苯系物及吡啶等杂环化合物[1]。邻二甲苯是一种典型的苯系物污染物，由于其毒性大和难生物降解的性质使得传统生物法对其处理效果不佳[2]。任源等[3]研究发现焦化废水经生物处理后的出水中仍含有苯类物质，因此，向生物处理系统中投加从自然界中筛选出的高效菌[4]，从而提高对目标污染物的去除率，受到了国内外广大环保者的关注。目前，已报道的降解苯系物的微生物有假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、红球菌属（Rhodococcus sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）等，但其对苯系物的降解速率都较低并且对高浓度的苯系物的耐受性较差[5-7]。

本研究从长期受焦化废水污染的土壤中筛选得到一株能以邻二甲苯为唯一碳源的高效降解菌，对该菌进行了生理生化和16S rDNA鉴定，并就其降解和生长特性进行了研究，为对邻二甲苯的生物强化处理提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

实验所用菌源取自武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水处理厂内长期受焦化废水污染的土壤，呈黑色。

1.2 试剂

邻二甲苯及正己烷为色谱纯标准，均购自国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 培养基

LB富集培养基：NaCl 1.0g，蛋白胨 1.0g，酵母提取物0.5g，蒸馏水定容至100mL，调节pH=7.2左右。

邻二甲苯无机盐培养基：Na2HPO41.5g，KH2PO41.5g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.02g， CaCl20.01g，2mL微量元素储备液，蒸馏水定容至1000mL，pH值约为7.0，120℃、0.1～0.15MPa高压锅内灭菌后加入邻二甲苯作为唯一碳源。

平板培养基：每100mL LB液体培养基中各加入约2g左右琼脂粉。

1.4 主要仪器

T6-新世纪型紫外可见光分光光度计，北京谱析仪器有限责任公司。

1.5 菌株的筛选

称取15g土壤加入装有100mL自来水的锥形瓶中，振荡24h，静置后离心，取5mL上清液接种于已灭菌的LB培养基内富集培养24h。取2mL富集的菌液转接至含有100mg/L邻二甲苯的无机盐培养基中于30℃、150r/min下培养，待培养基由澄清变浑浊后取2mL菌液接入底物浓度更高的无机盐培养基中同条件下培养，以此来驯化邻二甲苯降解菌，邻二甲苯的浓度分别为100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、2000mg/L。因为邻二甲苯难溶于水且易挥发，本实验在无机盐培养基中加入0.7%（体积比）吐温-80助溶[6]，并用封口膜封住瓶口，保证邻二甲苯基本不挥发。将驯化后的菌液采用稀释涂布平板和平板划线法分离、纯化得到单菌落，然后检测各菌株对底物的降解率。

1.6 菌种的鉴定

将降解速率最高的一株单菌菌液稀释涂布到LB平板上，于35℃生化培养箱中培养24h，从菌落的外形、大小、颜色等方面来观察。生理生化特征实验参考文献[8]来进行。提取细菌DNA[9]，16S rDNA PCR扩增，产物回收纯化后送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。

1.7 高效菌降解特性

（1）将高效菌接入含有1000mg/L邻二甲苯的无机盐培养基中，探究不同温度、pH值、摇床转速对其降解能力的影响，找出其适宜的生长条件，研究不同底物浓度时菌株的降解特性，每组实验均设置对照组。

（2）对菌株降解邻二甲苯的过程进行动力学研究。

（3）将高效菌按接种量2%分别接入含有250mg/L的苯、甲苯、喹啉、己二酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、吡啶、苯酚和邻甲酚的无机盐培养基中，在其适宜的生长条件下培养，间隔一段时间取样检测菌密度。

（4）将高效菌加入实际焦化废水中，考察其对COD的降解情况。锥形瓶中溶液的组成如下：①实验组，12mL废水原水+83mL蒸馏水+5mL菌液；②对照组，12mL废水原水+88mL蒸馏水。将锥形瓶放在35℃、150r/min恒温摇床中培养，定时取样检测COD的浓度。

1.8 分析方法

（1）细菌的菌密度由紫外分光光度计测定培养液在波长600nm处的吸光度值表示；邻二甲苯含量的测定采用紫外分光光度法。由于邻二甲苯难溶于水，本实验均采用正己烷等体积整瓶萃取培养基中剩余的底物，于波长210nm处测定邻二甲苯含量；COD的测定采用重铬酸钾法。

（2）邻二甲苯降解率的计算如式(1)。

式中，C0为对照组中残留底物浓度，mg/L；C1为实验组中残留底物浓度，mg/L。

2 结果与讨论

2.1 高效菌的筛选与鉴定

经过分离纯化，得到10株能够降解邻二甲苯的菌株，选取其中降解能力最好的一株LJ5来进行后续研究。菌株LJ5为革兰氏阴性菌，菌落呈圆形，微凸，表面湿润光滑。通过菌落形态和生理生化试验结果初步推断菌株LJ5与假单胞菌（Pseudomonas sp.）相似。

对菌株LJ5进行16S rDNA测序后，将测得的基因序列输入到Blast中在线进行比对，得到分析数据，其中与菌株LJ5序列相关性达到99%甚至更高的均是假单胞菌，因此可以判断LJ5在分子生物学上归属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

2.2 高效菌的降解特性

2.2.1 温度对菌株降解邻二甲苯的影响

温度主要通过影响微生物体内酶的活性从而对细菌的生长和降解性能产生一定的促进或抑制作用。温度过高或过低都会使酶的活性降低，只有适宜的温度才有利于微生物的生长和代谢。在pH值为7.0、摇床转速为150r/min的条件下，不同温度对邻二甲苯降解率的影响如图1所示。

图1 温度对菌株LJ5降解性能的影响

从图1中可以看出，在25～35℃之间，随着温度升高，邻二甲苯的降解率增大，在35℃时达到98.75%，而40℃时有所下降。这可能是因为25℃时温度过低使得微生物体内酶的活性较差，从而降解能力变差；40℃时温度过高，导致细菌细胞内蛋白质酶的活性降低甚至失活。在24h之前，30℃、35℃和40℃时的降解曲线基本重合，这可能是因为前期营养物质丰富，环境对其影响不大，随着时间的延长，底物被消耗，温度对高效菌的影响开始显著。因此，菌株LJ5的适宜生长和降解温度为35℃。2.2.2 培养基初始pH值对菌株降解邻二甲苯的影响

pH值能够影响微生物的细胞膜所带的电荷和改变培养基中有机物的离子化程度，因此是保证微生物能否正常生长和代谢的一个重要因素。在培养温度为35℃、摇床转速150r/min的条件下，不同培养基初始pH值对邻二甲苯降解率的影响如图2所示。

从图2可以看出，pH=5.0时，48h后，菌株LJ5对邻二甲苯的降解率为25.2%，该株菌在酸性条件下很难生长。当pH=7.0～8.0时，30h后其降解率均可达到90%以上，随着pH值的继续增大其降解率又有所下降，表明菌株LJ5对环境pH值比较敏感，其适宜pH范围为7.0～8.0，这与焦化废水生化处理时的水质条件相吻合。经过约48h培养后测定各摇瓶中培养液的终态pH值，初始pH值为5.0～9.0的锥形瓶中的终态pH值分别变为4.14、4.03、5.11、6.18、6.64。结果显示，摇瓶中的终态pH值均略有下降，这可能是因为菌株LJ5在生长过程中产生了酚类等显酸性物质。

2.2.3 摇床转速对菌株降解邻二甲苯的影响

摇床转速影响体系内的溶解氧溶度和微生物与底物的充分接触，因为本实验用封口膜封住瓶口，因此主要影响因素应该为后者。在温度为35℃，培养基初始pH值为7.0的条件下，不同摇床转速对邻二甲苯降解率的影响如图3所示。

图2 培养基初始pH值对菌株LJ5降解性能的影响

图3 摇床转速对菌株LJ5降解性能的影响

从图3可以看出，摇床转速为100r/min时菌株对邻二甲苯的降解率较低，这可能是因为转速过低导致菌株与底物不能充分接触或者反应时间较短。当转速在150～250r/min时，48h后邻二甲苯的降解率都达到了90%以上，差别不明显，结合实际生产中的可行性和成本考虑，选择菌株LJ5的适宜摇床转速为150r/min。

2.2.4 菌株LJ5对不同浓度邻二甲苯的降解特性

在温度为35℃、培养基初始pH值为7、摇床转速为150r/min的条件下，将菌株LJ5按接种量2%接入分别含50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L邻二甲苯的无机盐培养基中培养30h，得到邻二甲苯降解率结果如图4所示。由图4可见，当邻二甲苯浓度低于200mg/L时，其降解速率随着邻二甲苯浓度的提高而增加；邻二甲苯浓度200mg/L时，降解速率达到99%，在此之前细菌与底物表现为联合控制阶段；邻二甲苯浓度高于500mg/L后，降解速率开始下降，但保持在90%以上；当邻二甲苯浓度增加至1500mg/L之后，其降解率明显下降，底物的毒性对细菌表现出明显的抑制作用，但其降解率仍然高于70%。段云霞等[10]筛选出的菌株TD3在甲苯浓度高于50mg/L时其降解率开始下降，而LJ5对比其对高浓度苯系物具有更强的耐受性，在处理较高浓度废水时具有明显的优势。

图4 邻二甲苯浓度对菌株LJ5降解率的影响

2.2.5 菌株LJ5的降解动力学

采用Monod方程[式(2)]对菌株LJ5在邻二甲苯浓度为1000mg/L时的降解动力学实验数据（图5）进行拟合，并由双倒数法作图得出1/v与1/S的关系（图6），通过回归分析得出Monod方程的参数。

式中，v、vmax为底物的降解速率和最大底物的降解速率，mg/(L·h)；Ks半饱和常数，mg/L；S为底物浓度，mg/L。

图5 菌株LJ5的降解曲线

图6 1/v～1/S关系图

由图6得出菌株LJ5降解邻二甲苯的动力学方程见式(3)。

得Km=64.32mg/L，当S≫64.32mg/L时，最大降解速率vmax=43.29mg/(L·h)。霍丹群等[11]筛选的一株甲苯降解菌的最大降解速率仅为0.221mg/(L·h)，高效菌LJ5在降解邻二甲苯时具有快速的降解速率，对比已查阅文献中筛选到的苯系物降解菌具有更大的实际意义。

2.2.6 菌株LJ5的降解广谱性分析

菌株LJ5在含不同底物的无机盐培养基中生长48h后的菌密度如表1所示，在含有苯、甲苯这类苯系物的无机盐培养中LJ5生长良好，因为它们与邻二甲苯有相似的分子结构，LJ5能耐受这类化合物的毒性将其作为唯一碳源，合成自身生长所需的物质；喹啉和吡啶均属于氮杂环类化合物，但LJ5仅能在喹啉中生长，这可能是因为喹啉的分子结构中含有一个苯环，更易于被LJ5利用；己二酸二辛酯和邻苯二甲酸二丁酯这类增塑剂在生物处理时很难被微生物利用，而LJ5在其中具有一定的生长能力和去除效果；对于苯酚和邻甲酚这些酚类物质，LJ5则不具有降解能力。由表1可看出，LJ5在处理成分复杂的废水体系中能同时去除多种有机物，这对降低废水COD有巨大的潜力。

表1 广谱性分析

为检验菌株LJ5在实际废水中的降解能力，将菌液投加至稀释的焦化废水（COD = 610mg/L）中，48h后COD降为398.11mg/L，降解率达到34.74%，未加入菌液的对照组COD基本没变。这说明LJ5能很好地适应焦化废水中种类繁多的有机物的毒性，并能将其中部分有机物降解，这与表1中LJ5的广谱性相吻合，LJ5具有很大的实际应用价值。

3 结 论

（1）以邻二甲苯作为唯一碳源，从长期受焦化废水污染的土壤中分离得到一株邻二甲苯高效降解菌LJ5，结合菌株菌落形态、生理生化特征实验和16S rDNA测序分析，菌株LJ5为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌。

（2）通过单因素实验得到菌株LJ5的适宜降解条件为：培养温度35℃，pH=7.0～8.0，摇床转速150r/min。菌株LJ5在邻二甲苯浓度高达2500mg/L时，对其的去除率在30h内可达到70%，它对邻二甲苯的降解符合Monod动力学方程，当邻二甲苯浓度远远大于64.32mg/L时，LJ5降解底物的速率最高，达到43.29mg/(L·h)。

（3）菌株LJ5能在多种有机物中生长，将菌液投加至焦化废水48h后可使废水COD从610mg/L降为398.11mg/L，降解率达到34.74%。

参 考 文 献

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研究开发

Separation and biodegradation characteristics of a o-xylene degrading strain

CHEN Pei1，YAN Jiabao1，2，WU Wenli1，HU Xixi1
（1Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China；2Officer of Academic Affairs of Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China）

Abstract：With o-xylene as the sole carbon source，a strain (LJ5) was separated from the soil which was contaminated in the long-term by coking waste water. This strain was identified as Pseudomonas sp. based on its morphology，and 16S rDNA gene sequence. The optimum initial temperature，pH，and shaking speed for B1 utilizing pyridine are 35℃，pH=7.0—8.0 and 150 r/min，respectively. The o-xylene degradation rate was 73% when LJ15 was cultured under o-xylene concentration of 2500mg/L，and the degradation kinetics of o-xylene could be described by the Monod model. When o-xylene concentration was ≫64.32mg/L，the degradation rate of strain LJ5 reached an maximum of 43.29mg/(L·h). Strain LJ5 could grow well in the coking waste water which allowed the degradation rate of COD to be 34.74%.

Key words：o-xylene; separation; degradation; kinetics

基金项目：湖北省自然科学基金重点项目（2011CDA054）、武汉科技大学研究生创新创业基金重点项目（JCX0006）及武汉科技大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201310488009）。

收稿日期：2015-06-30；修改稿日期：2015-07-13。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.02.035

中图分类号：X 784

文献标志码：A

文章编号：1000–6613（2016）02–0565–05