用蛋白质指纹技术预测局部晚期胰腺癌伽玛刀治疗疗效的研究报告*

张永亮耿丽袁慧欣石磊杨曦裴毅



用蛋白质指纹技术预测局部晚期胰腺癌伽玛刀治疗疗效的研究报告*

张永亮①耿丽①袁慧欣①石磊①杨曦①裴毅②

【摘要】目的：使用蛋白质指纹技术（SELDI）预测伽玛刀治疗局部晚期胰腺癌治疗效果的临床应用价值。方法：选择2010年2月-2014年10月本院35例行伽玛刀胰腺癌患者，于治疗前抽血保存于-80 ℃低温冰箱，伽玛刀治疗后2个月，按WHO实体间质谱技术（SELDE-TOF-MS），通过分析血清特异性蛋白质质谱图，寻找差异蛋白指纹。结果：有效组与无效组中共检测出56个蛋白质峰，其中丰度（M/Z）为3337、9234、11 650的蛋白质组指纹两组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中无效组上调的峰M/Z 为3337、11 650，下调的峰M/Z为9234。结论：使用SELDI可以预测伽玛刀治疗局部胰腺癌的临床疗效，为临床治疗提供指导。

【关键词】蛋白质指纹技术； 胰腺癌； 伽玛刀

①武警山西总队医院 山西 太原 030006

②山西大医院

First-author’s address：The Armed Police Corps Hospital General Department in Shanxi， Taiyuan 030006， China

胰腺癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率近年来在我国逐年上升。随着胰腺癌的影像学诊断技术及生物学检测技术不断提高，胰腺癌的诊断有了一定的进展，但该疾病的早期诊断问题依然存在且尚未得到圆满解决[1]，大部分诊断时已为晚期，失去手术治疗机会，预后极差，75%患者常在诊断后年内死亡[2]。5年生存率为5%以下，明显低于其他恶性肿瘤[3-4]。现阶段，全世界针对晚期胰腺癌的治疗无有效治疗手段，我国也结合自身国情，不断探索新的、有效的治疗途径。近年来，伴随着计算机、电子技术、分子生物学的不断发展，立体定向放射治疗技术应用而生，γ刀即γ射线立体定向放射外科（治疗）在我国得到长足发展。因γ刀较常规放疗明显的优势是对瘤体部位可给予较高的照射剂量，但对周围正常组织影响小，在治疗局部晚期胰腺癌取得很好的短期治疗效果，且大多数患者均能耐受。体定向放射治疗逐渐被认为是治疗不能手术切除胰腺癌的主要手段之一[5-6]。但在临床中也发现，部分患者在治疗后效果差，而往往在肿瘤明显增大后才发现进展，最佳的治疗价值已经失去。针对这一问题，笔者利用蛋白质-飞行时间质谱（Surface-enhance laser desorption ionization，SELDI）技术对胰腺癌伽玛刀治疗后疗效进行前瞻性研究，结果汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年2月-2014年10月在本科住院治疗的胰腺癌患者35例，其中男21例，女14例；年龄36～80岁，中位年龄54岁；入院前都进行肿瘤标志物（CA19-9、CEA等）检测、超声及CT等检查。其中15例病理诊断为腺癌，3例病理诊断为黏液腺癌；有5例侵犯至胆管，有4例侵犯至临近大血管者，有4例肿瘤直接侵及至十二指肠，有6例侵犯至胰腺周围组织；肿瘤平均直径>5 cm者10例，平均直径<5 cm者25例。入组标准：（1）化验血细胞分析大致正常；（2）经组织病理学或细胞学诊断为胰腺癌，同时排除发生远处转移者，根据美国癌症联合委员会（AJCC）肿瘤分期标准，诊断为局部晚期胰腺癌者；（3）治疗前行超声、CT断层扫描、磁共振或PET-CT等影像学检查，经临床诊断为胰腺癌；（4）患者拒绝行手术治疗或因内科疾病本能行手术治疗或患者经外科会诊，不适合行手术治疗；（5）心、脑、肺、肾等器等明显功能在障碍；（6）患者治疗前KPS评分为60～100分；（7）能够耐受固定体位30 min以上；（8）预计生存期在3个月以上。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有伽玛刀治疗患者在治疗前，晨起采空腹静脉血约3 mL（非抗凝管），静置，离心处理后，分离出血清，放置于-80 ℃低温冰箱。

1.2.2 主要仪器、软件及试剂 立体定向伽玛射线全身放射治疗系统（SGS-Ⅰ型，深圳海博公司）。能量吸收分子EMA，HFPF缓冲盐（Sigma公司），MATLAB 7.0.1软件，Biomarker Wizar、CM10型蛋白质芯片及其分析软件ProteinChip 3.2.0（Ciphergen公司），PBS-Ⅱc表面增强飞行时间质谱仪（SELDITOF-MS），CHAPS缓冲盐（Sigma公司）。PBSⅡc型蛋白质芯片飞行时间质谱仪（Ciphergen公司），LDZ5-2型低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂），MDF-382型-80 ℃冰箱（SANYO公司），振荡器（MS1 Minishaker），PB20型pH测量仪（SARTORIUS公司），ER-182A型电子天平（A&D公司），2、10、20、100、200、1000 μL微量加样枪（Gilson公司），Tips P20，P200，P1000 （AXYGEN公司），50 mL离心管（CORNING公司），0.5 mL，1.5 mL微形离心管（AXYGEN公司），Biomarker Patterns Software（Biorad公司），SPSS 16.0（SPSS公司），三氟乙酸（TFA）（Sigma公司），乙腈（CAN），HPLC级（Sigma公司），无水醋酸钠（NaAc）（Sigma公司），3-[3-（胆酰氨丙基）二甲铵基]丙磺酸内盐（CHAPS）（Sigma公司），Tris碱（Sigm公司），氯化氢（HCL）（Sigma），水，HPLC级（Sigma公司），尿素（urea）（Sigma公司），SPA （Sigma公司），氯化钠（NaCl）（Sigma公司），氢氧化钠（NaOH）（Sigma公司），二硫基苏糖醇（DTT）（Sigma公司），羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma公司）。

1.2.3 试验方法 （1）血清标本的处理：首先通过冰浴解冻血清标本，离心2 min（10 000 r/min）后，抽取血清样品5 μL，其中加入10 μL 9M尿素，振荡30 min后，加入180 L缓冲液稀释（100 mmol/L NaOAc pH 4.0），于4 ℃恒温下，按10 000 r/min离心2 min，取出上清液待用。（2）WCX2芯片处理：小心地取出WCX2的芯片，在其背后标记时间、芯片种类以及操作者姓名等资料；打开生物芯片处理器（Bioprocessor）将芯片放入，在组装生物芯片处理器时，要避开加样孔，把标有”A”的一头的芯片靠外端放置，同时注意密封；每孔分别加入200 μL结合缓冲液（50 mM NaAC，pH 4.0），置于振荡器上（MS1 Minishaker），按400～600 r/min，震荡5 min，后甩掉缓冲液。按上述操作重复1次。操作过程中要注意保持芯片上每个点的表面湿润，加缓冲液后如发现芯片表面有气泡，用取液器吹去，枪头避免接触芯片上各点的表面；在芯片处理器每孔中分别加入100 μL处理好的样品，4 ℃下，置振荡器中（MS1 Minishaker）按400～600 r/min，震荡1 h。甩出样品后，将样品甩入预装消毒剂的容器中；每孔分别加入200 μL的结合缓冲液（50 mM NaAc），置于振荡器中（MS1 Minishaker），400～600 r/min，室温震荡5 min，甩去孔中的液体（注意不要甩的太干），重新加入结合缓冲液200 μL，继续上述操作1次。每孔分别加入200 μL HPLC水，立即甩出；拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔中分别加如SPA 0.5 μL，再次待干后，重复加SPA 0.5 μL一次；用CM10 蛋白芯片阅读仪读芯片（SPA为50%乙腈和0.5%三氟乙酸的饱和溶液）。（3）收集数据：设定检样激光强度为195，检测灵敏度为8，收集数据质荷比（M/Z）范围为1～2 KD，收集位置为20～80，平均每点收集20次，总点数收集为140次。为控制误差低于0.1%，在收集实验数据之前，使用蛋白芯片（All-inone）对仪器进行校正。通过质量控制蛋白质芯片进行重复性检测。

1.3 伽玛刀治疗方法 （1）CT定位，定位前患者空腹6 h，定位前30 min，将浓度76%的20 mL复方泛影葡胺稀释为300～400 mL后服下，更好地显示胃、十二指肠和小肠的位置；（2）取伽玛刀定位负压床，其上固定有三维坐标的立体定向体架，患者双手举置于额头前，将负压袋置于定位床中，进行体位固定，固定胸腹部，体表标记重复摆位点；（3）采用CT模拟定位技术，平静呼吸下行腹部CT增强扫描（建立外周血静脉通道，用碘海醇300 mg置入注射器进行高压泵注射），扫描范围通常取膈顶至4腰椎椎体水平，层厚为3～5 mm，层间距5 mm，通常包括肿瘤范围、局部淋巴引流区、肝脏、肾脏、胃、十二指肠以及部分肠道等，通过计算机获得定位影像资料；（4）CT图像通过网络传输到伽玛刀治疗计划系统（treatment plan system， TPS），医生在增强CT图像上勾画靶区，通过图像处理后，输出治疗文件；（5）根据患者的状况、肿瘤靶区（grosstarget volume， GTV）、临床靶体积（clinical target volume，CTV）、计划靶体积（planning target volume， PTV）以及治疗目的来调整射线剂量具体分布及放射治疗方案。PTV应覆盖100%CTV，将等剂量曲线设定为60%，靶区相邻的十二指肠射线受量控制在15%～30%，超过5 cm的肿瘤单次周边照射剂量控制在2.5～3.5 Gy，不超过5 cm的肿瘤单次周边照射剂量控制在3.0～4.0 Gy；（6）分次剂量为300～400 cGy，次/周，治疗次数为8～12次，放射总剂量为3500～4500 cGy。

1.4 分析方法

1.4.1 疗效评价标准 评估近期疗效参照世界卫生组织实体瘤通用评价方法作为评价标准，共分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）以及进展（PD）。通常以CR、PR为有效。完全缓解为肿瘤完全消退至少4周以上，无新的病灶出现；部分缓解为肿瘤消退≥50%，至少维持4周且无新的病灶出现；稳定为肿瘤消退<50%或增大<25%；病变进展0为肿瘤增大≥25%或出现新的病灶。疗效于伽玛刀治疗后2个月评定。

1.4.2 分组方法 根据WHO实体肿瘤疗效评价标准将伽玛刀治疗后2个月的患者分成治疗有效组（CR+PR）和治疗无效组（SD+PD）。

1.5 统计学处理 使用Biomarker Wizard 3.1软件统一进行分析，通过比较有效组和无效组血清蛋白质指纹图谱数据，寻找两组表达差异性的蛋白质峰，通过此软件进行分析、计算，进行比较二组中相同质荷比的蛋白质含量（丰度）的P值，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

通过比较有效组和无效组血清特异性蛋白质质谱图，共检测出56个蛋白质峰，经过Biomarker Wizard 3.1软件分析，其中M/Z为3337、9234、11 650的蛋白质组指纹（丰度）差异有统计学意义（P<0.05），其中无效组上调的峰M/Z为3337、11 650，下调的峰M/Z为9234。见表1。用SELDI技术描述35例患者的蛋白质组指纹见图1。

表1 有效组与无效组指纹丰度（M/Z）比较

图1 35例患者的蛋白质质谱图注：横坐标为M/Z（相对分子量），纵坐标为蛋白质的相对丰度，为质谱图

3 讨论

近年来，我国胰腺癌的治疗水平有了长足的进步，但其整体疗效仍不令人满意，尤其对晚期胰腺癌无有效治疗手段。目前正寻找更加有效治疗手段及新路径。伽玛刀治疗因其精度高，照射范围小，正常组织受照剂量低等优点，通常为副作用相对小、近期疗效较好，且能快速缓解症状，在胰腺癌的放射治疗中独树一帜，是治疗胰腺癌可行手段[7-9]。有临床研究证实，对早期局限期病灶，其治疗效果可与手术相当[10]，但笔者在临床中也发现，也有部分患者经伽玛刀治疗后，效果差，如果寻找一种监测手段，能够提前预知伽玛刀治疗的疗效，就能有选择性应用该方案进行胰腺癌的治疗，提高治疗效果，使患者受益。

伽玛刀作用机理是通过伽玛刀射线照射，使病变组织细胞的RNA或DNA链断裂，破坏某些辅酶或生物酶，影响线粒体能量系统，进而发生病灶组织坏死、液化、吸收，取得治疗目的[11]。既往研究也证实，细胞受到电离辐射后，通过对DNA损伤，最终的导致DNA双链断裂，其中包括直接及间接作用。肿瘤细胞抵抗射线杀伤的主要机制之一为DNA损伤修复（DNA DamageRepair， DDR），如果细胞的DDR系统受到了损害影响，其放射敏感性会明显增加，目前研究也证实，通过监测DNA损伤指标γ-H2AX蛋白表达水平及DNA损伤修复指p-ATM、Ku80、Rad51等蛋白的表达水平的变化，可以直接了解射线的照射效果[12-13]。目前对放疗耐受的机理研究相对少，笔者推测与各种细胞因子及多种未知蛋白质参与的多种通路有关，且与恶性肿瘤的多变异特性和异质体特性也有明显关系。

SELDI-TOF-MS技术，简称为SELDI技术，即表面增强激光解析离子飞行时间（time of flight）质谱技术，是近年来发展起来的新的生物检测技术，该技术利用蛋白质芯片技术进行研究，成为研究蛋白质的有效平台。由于该技术可以同时检测大量未知蛋白质的，通过检测软件进行分析可得出特异性蛋白的质荷比。然后直接对其进行定性、定量分析，可以使指纹图准确描述和量化[14]。因而，通过该技术可以发现一些特异性蛋白，应用疾病早期诊断及治疗疗效监测，目前已经广泛应用于人体尿液、血清等体液的测定[15]，本研究工作以此为理论指导，通过检测伽玛刀治疗的胰腺癌患者血清，描述其蛋白质组指纹，利用Biomarker Wizard软件分析伽玛刀治疗后有效组和无效组之间有显著差异的蛋白指纹。

通过利用蛋白质芯片的大规模的检测，可以从胰腺癌治疗患者的血清中找到微量差异蛋白质的变化，利用这一组蛋白质组成的血清蛋白质谱图的特征变化，为寻找性提供了有效的线索。既往应用蛋白指纹技术通过对肺癌、胃癌、肠癌等对化疗耐药性研究，取得很好预测效果，裴毅等[16-17]界定了SELDI指纹中M/Z8693的丰度与疗效预测有关并得出的SELDI指纹M/Z8693，丰度15%的肺腺癌患者为服用吉非替尼治疗优势人群，在随后的研究中也得到进一步证实，目前已应用于临床。本研究共选择35例患者，其中伽玛刀治疗有效者23例，无效者12例，在捕获的56个蛋白质中，大部分无差异，其中仅有3个差异蛋白质峰。本研究检测到M/Z为3337、9234、11 650的蛋白质组指纹（丰度）在有效组和无效组之间比较，差异有统计学意义，说明这3种蛋白质对胰腺癌治疗效果有着更加重要的意义，同时提示在胰腺癌治疗患者中发生3种蛋白质的特征性改变。本研究证实无效组上调的峰M/Z为3337、11 650，下调的峰M/Z为9234，在下一步临床工作中，以此研究作为平台进行大样本临床验证工作，进一步确定其预测疗效的指标，更好有针对性地进行有效治疗。

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Using Protein Fingerprint Technology to Predict the Curative Effect of Gamma K nife Cure Locally Advanced Pancreatic Cancer Therapy Research Report/

ZHANG Yong-liang， GENG Li， YUAN Hui-xin，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（01）：004-008

【Abstract】Objective： Using protein fingerprint technology （SELDI） to predict the efficacy of gamma knife treatment of locally advanced pancreatic cancer research the clinical application value. Method： The 35 patients with pancreatic cancer were selected from February 2010 to October 2014， during the gamma knife treatment from blood stored prior to treatment to -80℃ low temperature refrigerator. Two months after gamma knife treatment，according to the WHO evaluate curative effect of therapeutic effect evaluation standard of solid tumors， and effective and ineffective group enhances the weak cationic CM10 chip combination show， serum specificity protein mass spectra，techniques were compared， using the time of flight mass spectrometry （SELDE-TOF-MS）. Result： In 56 protein peak detect， M/Z 3337， 9234， 11 650， proteomic fingerprint （abundance） which were significantly different between effective and ineffective group （P<0.05）. Compared with the effective group， invalid group raised its peak M/Z 3337， 11 650， its peak of 9234 M/Z. Conclusion： Using SELDI technology can predict the clinical curative effect of gamma knife treatment of ancreatic cancer.

【Key words】The protein fingerprint technology； Pancreatic cancer； Gamma knife

收稿日期：（2015-09-02） （本文编辑：王宇）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.01.002

通信作者：裴毅

*基金项目：山西省自然基金在研项目（2012011043-3）