儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型检测及临床研究

郭　华, 丁　惠，李慧娟，颜卫红

(山东省立医院集团东营医院, 1. 儿科; 2. 手术室; 3. 血液科, 山东 东营, 257091)



儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型检测及临床研究

郭华1, 丁惠2，李慧娟3，颜卫红1

(山东省立医院集团东营医院, 1. 儿科; 2. 手术室; 3. 血液科, 山东 东营, 257091)

摘要:目的探讨儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及简并引物扩增并测序，利用Genbank核对分型，检测东营地区2008年1月-2012年2月63例临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎患儿脑脊液中的肠道病毒(EV)RNA，并结合临床特点进行分析。结果63例病毒性脑膜炎、脑炎患儿的脑脊液经RT-PCR检测，EV感染阳性率为74.6%(47/63)。利用通用引物筛选出的阳性标本，并采用简并引物经两次PCR共获得阳性结果31例(66.0%)。随机抽取23条阳性片段进行克隆测序，测序结果与GenBank标准EV毒株进行同源性对比分析，相关序列同源性均在97%以上。肠道病毒引起中枢神经系统感染的临床特征在各个年龄组有所不同, 33例急性期EV患儿脑脊液中白细胞数不同程度增高(均数76×106/L)。结论EV是儿童无菌性脑膜炎、脑炎的最主要的病原体。采用RT-PCR可以快速准确的检测出中枢神经系统感染的肠道病毒；采用分型引物扩增并测序，将EV的VP1部分序列与GENBANK中的EV标准毒株进行对比，根据基因序列的同源性进行EV型别鉴定是一种切实可行的方案。EV引起的病毒性脑膜炎临床症状一般较轻、无特异性，多数患儿CSF中白细胞高于正常范围。

关键词:肠道病毒; 病毒性脑膜炎、脑炎; 逆转录聚合酶链反应

病毒性脑膜炎、脑炎是儿童时期最常见的中枢神经系统感染性疾病，而肠道病毒(EV)是引起病毒性脑膜炎第一位的病原体[1]。据统计，美国每年有1～3 000万人发生各种类型EV感染，其中EV性脑膜炎约占无菌性脑膜炎总数的85%[2], 而国内报道[3-4]肠道病毒感染占病毒性病毒性脑炎、脑膜炎的69%～84%。本研究以山东省东营地区2008年1月-2012年2月病毒性脑膜炎、脑炎住院儿童病例63例为研究对象，对脑脊液中EV行分子生物学检测分型，并探讨患儿临床特征，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2008年1月-2012年2月临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎患儿为研究对象，均符合依据诸福棠实用儿科学(第7版)[5]中病毒性脑膜炎、脑炎相关诊断标准，其中男43例，女20例，年龄0.8～11岁，平均(6.7±0.2)岁。患儿入院当天行血常规生化检查，确定无禁忌证后行腰椎穿刺抽取脑脊液。阳性对照为中国科学院昆明生物学研究所提供的COXB3、ECHO30和EV71标准病毒株。阴性对照为结核、细菌性脑膜炎患儿脑脊液和磷酸盐缓冲溶液。

1.2方法

1.2.1EV RNA的提取和扩增：采用改良酸性胍-酚-氯仿一步法(AGPC)提取。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及简并引物扩增并测序，逆转录合成cDNA及PCR扩增使用德国Qiagen公司的One-Step试剂盒

1.2.2引物的设计与合成：通用引物根据EV5c端非编码区保守序列，引物1序列: 5c-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3c。引物2序列: 5c-CACYGGATGGCCAATCCA-3c, 扩增产物为194 bp的片段。此外，分型引物设计了3条简并引物，分别为引物02: 5c-ATGTAYGTICCICCIGGIGG-3c、引物03: 5c-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC-3c和引物01: 5c-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3c, 引物02和03分别与引物01扩增。扩增片段为450 bp的片段。

1.2.3扩增产物的检测：应用EV分型引物对VP1段进行RT-PCR后，产物经琼脂糖凝胶回收系统回收纯化。先将产物构建载体连接入质粒后转染进入大肠埃希菌，然后进行克隆测序，测序通用引物使用M13R(-48),使用ABI3730型DNA序列自动分析仪。EV型别确定序列结果输入Genbank, 运用BLAST程序进行相关序列的比较，分析结果同源性最高的序列即为相同型别。研究中采用的EV参比序列均取自Genbank数据库。

1.3统计学处理

采用SPSS 13.0软件，计数资料以%表示，率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1通用引物和分型引物检测下RT-PCR结果

采用通用引物进行扩增检测获得阳性结果43例(68.2%), 产物回收后再次行PCR扩增检测阳性结果47例(74.6%), 一次和二次PCR扩增检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.6222,P=0.4302)。经过通用引物筛选得到47例样本，利用分型引物一次PCR扩增检测得到阳性13例(27.7%), 二次PCR阳性结果31例(66.0%), 一次PCR和二次PCR比较，差异有统计学意义(χ2=13.8436,P=0.0002)。

2.2对照组检测结果

阳性对照：三株标准毒株(COXB3、ECHO30、EV71)均被通用引物成功扩增，电泳结果显示为片断大小为194 bp的清晰单克隆条带，见图1。阴性对照: 9例非开放性头外伤患儿脑脊液样本，通用引物扩增结果为阴性，见图2。

注:1为标准毒株扩增产物电泳条带,2~17为临床标本扩增产物电泳条带图1 阳性对照通用引物RT-PCR扩增产物电泳图

注:1~7为阴性对照标本扩增产物电泳条带,8为标准毒株扩增产物电泳条带图2 阴性对照组通用引物RT-PCR扩增产物电泳图片

2.3分型引物序列测定结果

随机选出23例行序列测定，全部测序成功。将结果通过BLAST系统与Genbank进行比对，相关序列同源性97%～99%, 见表1。

表1　23 例EV临床毒株与GenBank EV标准

2.4患儿临床表现和脑脊液检查结果

63例急性期患儿临床表现主要为发热、头痛、呕吐、易激惹。5岁以上患儿中94.1%(32/34)伴有不同程度的头痛，32.4%(11/34)伴有畏光的表现，17.6%(6/34)伴有疲劳、乏力、肌痛。对客观临床症状进行统计分析,发现5岁以下患儿发热、呕吐、腹泻发生率高于5岁及以上患儿，皮疹阳性率近似。仅有3例(4.76%)脑膜炎患儿发生惊厥。此外，脑脊液检查显示，33例白细胞计数增高，范围20～790×106/L(均数76×106/L), 其中≤300×106/L 28例(84.85%), 300～500×106/L 3例(9.09%)，≥500×106/L 2例(6.06%)；脑脊液蛋白含量增高者占44.68%, 2例>800 mg/L; 脑脊液葡萄糖含量降低者占34.04%。

3讨论

本研究首先以通用引物，对阳性标准毒株，临床标本及阴性对照组进行扩增检测，阳性标准毒株(COXB3、ECHO30、EV71)经RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，产物均为长度约194 bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增；所有阴性对照标本(取自结核、细菌性脑膜炎患儿)均不能被扩增检测。74.6%(47/63)的临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎的急性期CSF标本中可检测到清晰、无非特异性扩增的单克隆条带，提示在引起无菌性脑膜炎、脑炎的病原体中，肠道病毒仍占首位。相关研究[6]报道，EV感染占病毒性脑膜炎病原体的82.9%～85%, 占病毒性脑炎的10%～20%[7]。此外，研究中EV主要引起急性感染，但是否存在EV慢性低滴度持续性感染，仍需长期的随访观察。此外，研究中还观察到，多数EV感染患儿脑脊液中白细胞数高于正常范围，蛋白及葡萄糖含量基本正常，仅有少数病例出现轻度异常，与Sawyer等[8]研究结果基本一致。少部分患儿脑脊液中白细胞数可不增高，考虑可能与部分患儿病情较轻、病程较早有关,尚需进一步探讨。

EV常见血清型包括柯萨奇A7、9、11, 柯萨奇B1～5型，埃可4、6、12、30及EV71等[9]。VP1蛋白是EV主要结构蛋白之一，即参与维持病毒完整形态，又和病毒引起宿主细胞病变密切相关，此外，其还可作为病毒诊断抗原和DNA疫苗的候选基因[10-14]。本研究中，属同一型的VP1之间的同源性为97%～99%[15]，而研究显示不同型别间的VP1同源性只有74%～76%[16]，提示基因分型较传统血清学分型的优势。鉴于VP1可作小RNA病毒科内不同属的分类参考，有学者利用VP1的3'端设计的简并引物成功扩增出其中的51个血清型的标准毒株，其引物设计考虑到了VP1氨基酸序列的变异和密码子的简并性，四重密码子简并处设计为脱氧次黄嘌呤核苷。本研究中，对通用引物筛选出的47例EV阳性的脑脊液样本用简并引物进行扩增检测，其中31例结果呈阳性，且随机抽取脑脊液样本23例均被成功测序分型，提示通用引物与分型引物检测EV的可行性。应用分型引物结合GenBank标准毒株序列比对，能克服传统血清学分型方法耗时长、繁琐且有部分病毒株无法定型等缺点，更为准确地了解小儿EV感染的病毒型别特点。

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Molecular biology typing and clinical research of enterovirus infection in children with viral meningitis/encephalitis

GUO Hua1, DING Hui2, LI Huijuan3, YAN Weihong1

(1.DepartmentofPediatrics; 2.OperatingRoom; 3.DepartmentofHematology,DongyingPeople′sHospital,Dongying,Shandong, 257000)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the molecular biological types of enterovirus (EV) in infected children with viral meningitis or encephalitis. MethodsA Total of 63 children who suffered from viral meningitis/encephalitis between Jan. 2008 to Feb.2012 at Dongying area were recruited and their cerebrospinal fluid specimens were studied by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and degeneracy primers and sequenced to verify the Genbank classification. Their clinical features were also analyzed. ResultsThe positive rate of EV infection was 74.6 %( 47/63), and the positive results processed by twice PCR was 31 cases (62.0%). A total of 23 positive fragments were randomly selected to conduct the DNA sequencing, with a result of more than 97% by homologous analysis comparison with GenBank standard EV strain. The clinical characteristics of central nervous system infections caused by EV were various form different age groups. The white blood cells in cerebrospinal fluid of the 70.21% cases with acute EV infection were at a high level (with a mean of 76×106/L). ConclusionEV is the major pathogen of aseptic meningitis/encephalitis in children. The method of RT-PCR can detect enterovirus infection in central nervous system quickly and accurately. It is a feasible scheme that conducting EV type identification according to the gene sequence homology, which comparing the VP1 partial sequence in EV with standard EV in Genbank. The white blood cells

in CSF of most cases are higher above normal range.

KEYWORDS:enterovirus; virus meningitis; encephalitis; reverse transcript ion and polymerase chain reaction

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11321792)

收稿日期:2015-11-12

中图分类号:R 742

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)01-035-04

DOI:10.7619/jcmp.201601011