DNA识别受体PYHIN家族及相关病毒免疫逃逸机制的研究

魏巍，汪速飞，倪明，余冰

1. 华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系, 武汉 430030； 2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉 430030



·综述·

DNA识别受体PYHIN家族及相关病毒免疫逃逸机制的研究

魏巍1，汪速飞1，倪明2，余冰1

1. 华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系, 武汉 430030； 2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉 430030

宿主细胞内的DNA识别受体可识别病毒核酸分子并激活细胞天然免疫反应，从而产生抗病毒效应；同时，病毒也进化出相应机制来逃避或抑制这种免疫反应。本文总结了宿主细胞内DNA识别受体PYHIN家族识别病毒核酸并激活细胞天然免疫反应的特点和分子机制，并讨论了病毒逃避宿主天然免疫应答的方式。

DNA识别受体；PYHIN家族；免疫逃逸

病毒感染可诱导机体产生天然免疫反应，是机体抵抗病原体入侵的第一道防线。机体天然免疫反应的产生主要由宿主细胞的模式识别受体(pattern-recognition receptor，PRR)识别病原体所表达的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern，PAMP)实现。PAMP为病原体共有的高度保守的分子特征，是宿主细胞广泛识别病原体的分子基础，包含病原体中的糖类、蛋白类及核酸类。PRR位于宿主细胞表面或胞内器室膜，可识别病原体的一些共有分子特征或组织损伤相关分子模式(damage-associated molecule pattern，DAMP)[1]，主要包括Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)和C型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLR)等[2]。

病毒感染宿主细胞后在胞内复制，导致病毒DNA聚集，因此病毒核酸被认为是胞内最主要的PAMP。研究发现，哺乳动物细胞具有一系列能激活宿主细胞天然免疫反应的检测和防御机制，如广泛存在于宿主细胞胞质与胞核中的DNA识别受体，包括PYHIN家族(PYRIN domain and HIN domain-containing)、环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine mono-phosphate synthase，cGAS)及DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA-dependent activator of interferon regulatory factor，DAI)等。病毒DNA被这些受体识别后，通过特异性配体蛋白的分级活化，如干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)等激活下游信号途径，促进炎性因子和趋化因子的表达，并诱导Ⅰ型或Ⅲ型干扰素(interferon，IFN)的产生，从而抵抗病毒感染。但最近许多研究发现，病毒已进化出一系列有效的机制，不仅可逃避宿主天然免疫感受器的识别，还可抑制PRR及其下游级联转导信号的激活。本文阐述了PYHIN家族识别病毒DNA并诱导天然免疫应答的分子机制，还讨论了病毒逃避宿主天然免疫应答的方式。随着越来越多的新型病毒及病毒变异体的出现，明确病毒引起机体产生天然免疫反应的分子机制，有利于探索病毒持续感染宿主细胞的内在机制，从天然免疫反应的角度来探索抗病毒感染的新途径，为抗病毒药物及疫苗研究提供新思路。

1　PYHIN家族的分子结构

以往研究发现，将外源DNA引入哺乳动物细胞的胞质中可诱导天然免疫应答。近年来陆续发现许多胞内DNA识别受体，其中PYHIN家族是已确定的胞内病毒DNA识别受体。人PYHIN家族包括黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)、γ干扰素诱导蛋白16(interferon γ-inducible protein 16，IFI16)、γ干扰素诱导蛋白X(interferon γ-inducible protein X，IFIX)、髓系细胞核分化抗原(myeloid cell nuclear differentiation antigen，MNDA)等，是一类N端含PYRIN结构域和C端含HIN200结构域的蛋白家族。AIM2和MNDA具有典型的PYHIN家族结构，而IFI16的C端含有HIN-A和HIN-B两个HIN结构域[3]，可被含有丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸(S/T/P)的沉默区间隔开。沉默区可被mRNA剪切调节，导致IFI16出现3种亚型(A、B、C)[4]。其中B亚型是主要表达型，广泛分布于人成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞和T细胞，目前较少有关于A和C型的报道。IFI16 HIN结构域含有2个连续的寡核苷酸折叠区(OB1和OB2)，与结合DNA相关；PYD结构域是具有一些特定功能的多功能结构域，可能与蛋白之间的相互作用有关。如AIM2和IFI16的PYD可与细胞凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)相互作用，激活炎性小体，导致炎症反应。IFIX可编码α1、α2、β1、β2、γ1、γ2这6种蛋白，其N端含有PYD结构域，但γ1、γ2型的C端不含有HIN结构域[5]。

2　PYHIN家族的细胞亚定位

绝大多数PYHIN家族成员如IFI16和IFIX在N端具有核定位信号(nuclear localization sequence，NLS)和核输出序列(nuclear export sequence，NES)。NLS可驱动β半乳糖苷酶使其定位于细胞核，NES可引起PYHIN家族成员向胞质移位，蛋白翻译后修饰、赖氨酸乙酰化等可影响其亚细胞定位[6]。AIM2主要表达于巨噬细胞和树突细胞，定位于胞质，识别胞质中的DNA。宿主DNA主要存在于细胞核和线粒体，而胞质中的DNA主要由病原体释放。IFI16可分别在胞核及胞质中识别外源DNA分子。

3　PYHIN家族对外源DNA的识别

早期有文献表明PYHIN家族成员AIM2可识别核酸，其OB区特定结合双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)[7]，启动AIM2炎性小体，随后AIM2寡聚化，其PYD区域与ASC的PYD区域结合，诱导ASC的寡聚化及炎性体的活化，然后通过ASC介导启动下游抗病毒信号的级联反应。ASC的CARD结构域可与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1, caspase-1)的CARD结构域结合，从而激活caspase-1，活化的caspase-1可导致白细胞介素1前体(pro-interleukin 1β，pro-IL-1β)和pro-IL-18裂解形成IL-1β和IL-18，引起特殊形式的细胞凋亡。在感染某些DNA病毒如牛痘病毒和小鼠巨细胞病毒时，缺乏AIM2的宿主细胞不能产生完整的免疫反应[8]。

PYHIN家族的另一成员IFI16是公认的能识别DNA的免疫监视器。以前研究认为IFI16是一种严格的核定位蛋白，只能在胞核中识别外源性的DNA，但后来陆续有研究发现IFI16在某些情况下可转移至胞质，因此也可识别胞质中的DNA。Dawson和Trapani最先提出IFI16可通过其C端结构域结合核酸[9]，IFI16 HIN结构域的OB1和OB2区允许DNA对接，其主要的结合靶基因是dsDNA[10]，但在特定情况下也可结合某些其他结构的核苷酸，如超螺旋结构核苷酸[11]、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)反转录中间体[12]等。OB1与OB2区的整体结构非常相似，但具有不同的DNA结合表面。最近一项研究表明，IFI16 HIN-B结构域通过linker区域和OB2 fold的氨基酸结合DNA骨架，可与DNA的两条链发生作用；而HIN-A结构域则通过两个OB fold的氨基酸来结合DNA骨架，特异结合一条DNA链，由此提示HIN-A具有能结合单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)的独特功能。该研究还提出IFI16 HIN-B结构域删除突变可减少IFN-β产生，而HIN-A突变体则增加IFN-β产生[13]，进一步表明IFI16 HIN结构域在DNA识别和IFI16介导的天然免疫反应激活中的功能。IFI16诱导IFN表达的通路已得到证实，在IFI16结合病毒dsDNA后，寡聚化组装成细丝并亚定位至胞质中，直接结合STING，引起TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)募集，从而引发依赖干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的IFN基因表达。此外，IFI16还激活炎性小体，导致具有活性的caspase-1产生和IL-1β生成[14]。一系列人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)研究发现，去除IFI16表达后HCMV复制显著增加，表明IFI16是病毒感染的一个限制性因素。Cristea等发现，HCMV感染中IFI16作为核酸PRR参与病毒诱导的STING-TBK1-IRF3通路激活，但可被pUL83病毒蛋白抑制[15]，由此表明IFI16是激活天然免疫反应必不可少的先天核酸PRR。然而，IFI16在细胞核中如何区分“自己”与“非己”DNA，尚不特别清楚。约翰霍普金斯医学院的研究人员认为，当外来DNA长度仅可容纳1个IFI16分子时，IFI16对外源DNA作出反应；当DNA片段长度超过60 bp，能容纳约4个IFI16分子时，IFI16发生强烈反应[16]。宿主DNA由于包装成非常短的DNA链，在IFI16识别时可与外源性DNA区分。

IFIX能否识别DNA引发机体产生天然免疫还不特别清楚，但最近有文献表明IFIX既可在胞质中也可在胞核中识别外源性dsDNA，并以非序列特异性的方式通过其HIN区结合诱导Ⅰ型IFN产生。HEK293细胞中IFIX过表达可阻碍单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)复制，而在原代成纤维细胞中敲除IFIX可增加HSV-1滴度[17]。IFIX与IFI16均可在胞核中识别DNA，并诱导机体产生天然免疫，但这两者之间有无协同机制还有待进一步确定。

关于MNDA功能的研究主要集中在骨髓分化、核糖体生物合成与成熟、调节细胞生长分化凋亡等方面。虽然MNDA也具有PYHIN家族的典型结构特点，但其能否识别DNA激活天然免疫还需深入研究。

4　病毒对宿主细胞天然免疫的逃逸

多数病毒具有一种有效机制来逃避或抑制宿主的天然免疫反应，其逃避DNA受体识别或阻碍下游信号分子激活的可能分子机制如下。

大多数DNA病毒能在宿主细胞的胞核中进行复制，因此其必须在核内逃避机体的免疫识别。病毒可通过降解DNA感受器或裂解IFN信号通路中的重要分子来逃逸，如HSV-1感染可激发核内IFI16蛋白酶体降解[18]。缺乏ICP0或编码促使ICP0失活基因的HSV-1突变株均不能导致IFI16降解，表明HSV-1 ICP0可直接靶向作用于IFI16，导致其降解，从而阻断其识别HSV-1 DNA而引发宿主天然免疫反应。登革病毒的蛋白酶复合物(NS2B-NS3)可与STING结合并将其裂解[19]，从而阻断诱导天然免疫的信号通路，降低IFN生成。病毒也可通过阻碍IFI16活化来逃逸免疫清除，如HCMV感染宿主细胞后可靶向作用于IFI16，但与HSV-1 ICP0降解IFI16的机制不同。IFI16能识别HCMV DNA，其外壳蛋白pUL83 N端结合至IFI16 PYD区，C端阻碍了IFI16寡聚化及随后的免疫信号[15]。研究发现，pUL83的Ser364磷酸化可降低其拮抗IFI16的能力，提示宿主激酶可调节该病毒蛋白的免疫抑制活性。最近有学者提出了HCMV拮抗IFI16的第二互补机制[20]，即在HCMV复制中pUL97结合IFI16并使其磷酸化，引起IFI16从胞核易位至胞质或错定位至多泡体(multivesicular body，MVB)，导致HCMV DNA在胞核中由于空间上无接触而不被识别。病毒也可通过修饰自身基因组来阻止宿主的天然免疫。以前研究发现HIV-1的ssRNA基因组可反转录成DNA，由于只有少数几个HIV-1 DNA拷贝整合，剩下的拷贝可能很易被细胞内感受器识别。已有文献表明，HIV-1使用宿主细胞中最丰富的3′→5′脱氧核糖核酸酶与3′-修复外切酶1(TREX1)结合和降解胞质中的过量HIV-1 DNA，使病毒逃逸被DNA感受器识别[21]。另外，一部分病毒也作用于STING，但并不引起其裂解，如人们熟知的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)。HBV聚合酶的反转录酶和核糖核酸酶H区与STING结合，可阻断Lys63连接的泛素化，从而抑制IFN-β产生[22]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)编码病毒IRF1(viral IRF1，vIRF1)，可与STING相互作用，从而防止TBK1募集，抑制TBK1介导的STING磷酸化和激活[23]。

近期研究发现，HepG2细胞系中存在相应的通路识别HBV DNA，从而激活宿主细胞的天然免疫反应，但在原代肝细胞和Huh7细胞系中未发现该通路的存在[24]，提示其可能是HBV持续感染肝细胞的因素之一。然而，在绝大多数细胞中均存在的通路为何在原代肝细胞中无法检测到，是由于某些特定蛋白的裂解还是其他通路的存在，需进一步研究。探索这些问题将有利于揭示HBV持续感染机制，并为HBV感染的防治提供新思路。

综上所述，病毒主要通过其自身蛋白靶向作用于DNA识别受体或其下游信号的重要分子，使其发生降解、功能抑制或空间隔离，或降低自身暴露的DNA水平来避免天然免疫的产生。

5　结语

多数文献已证实PYHIN家族中的绝大多数成员可识别DNA并引发机体产生天然免疫反应，在宿主病毒DNA识别受体及下游信号转导通路方面也取得了一系列进展，但这些受体在病毒感染时如何协调发挥作用仍不清楚。病毒感染过程中，既有天然免疫激活通路的存在，也有病毒逃逸机制的发生，这些协同或拮抗通路之间如何相互作用仍有待深入研究，而利用病毒逃避机体天然免疫的分子机制来为疫苗及新型抗病毒药物研究提供新思路是值得探讨的方向。

Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation [J]. Cell, 2010, 140(6): 805-820.

[2]Dambuza IM, Brown GD. C-type lectins in immunity: recent developments [J]. Curr Opin Immunol, 2015, 32: 21-27.

[3]Brunette RL, Young JM, Whitley DG, Brodsky IE, Malik HS, Stetson DB. Extensive evolutionary and functional diversity among mammalian AIM2-like receptors [J]. J Exp Med, 2012, 209(11): 1969-1983.

[4]Johnstone RW, Kershaw MH, Trapani JA. Isotypic variants of the interferon-inducible transcriptional repressor IFI 16 arise through differential mRNA splicing [J]. Biochemistry, 1998, 37(34): 11924-11931.

[5]Ding Y, Wang L, Su LK, Frey JA, Shao R, Hunt KK, Yan DH. Antitumor activity of IFIX, a novel interferon-inducible HIN-200 gene, in breast cancer [J]. Oncogene, 2004, 23(26): 4556-4566.

[6]Li T, Diner BA, Chen J, Cristea IM. Acetylation modulates cellular distribution and DNA sensing ability of interferon-inducible protein IFI16 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(26): 10558-10563.

[7]Hornung V, Ablasser A, Charrel-Dennis M, Bauernfeind F, Horvath G, Caffrey DR, Latz E, Fitzgerald KA. AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC [J]. Nature, 2009, 458(7237): 514-518.

[8]Dutton MF, Mwanza M, de Kock SD, Khilosia LD. Mycotoxins in South African foods: a case study on aflatoxin M1 in milk [J]. Mycotox Res, 2012, 28(1): 17-23.

[9]Dawson MJ, Trapani JA. The interferon inducible autoantigen, IFI 16: localization to the nucleolus and identification of a DNA-binding domain [J]. Biochem Biophys Res Comm, 1995, 214(1): 152-162.

[10]Jakobsen MR, Bak RO, Andersen A, Berg RK, Jensen SB, Jin T, Laustsen A, Hansen K, Østergaard L, Fitzgerald KA, Xiao TS, Mikkelsen JG, Mogensen TH, Paludan SR. IFI16 senses DNA forms of the lentiviral replication cycle and controls HIV-1 replication [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(48): E4571-E4580.

[11]Brázda V, Coufal J, Liao JCC, Arrowsmith CH. Preferential binding of IFI16 protein to cruciform structure and superhelical DNA [J]. Biochem Biophys Res Comm, 2012, 422(4): 716-720.

[12]Monroe KM, Yang Z, Johnson JR, Geng X, Doitsh G, Krogan NJ, Greene WC. IFI16 DNA sensor is required for death of lymphoid CD4 T cells abortively infected with HIV [J]. Science, 2014, 343(6169): 428-432.

[13]Ni X, Ru H, Ma F, Zhao L, Shaw N, Feng Y, Ding W, Gong W, Wang Q, Ouyang S, Cheng G, Liu ZJ. New insights into the structural basis of DNA recognition by HINa and HINb domains of IFI16 [J]. J Mol Cell Biol, 2016, 8(1): 51-61.

[14]Jin T, Perry A, Jiang J, Smith P, Curry JA, Unterholzner L, Jiang Z, Horvath G, Rathinam VA, Johnstone RW, Hornung V, Latz E, Bowie AG, Fitzgerald KA, Xiao TS. Structures of the HIN domain: DNA complexes reveal ligand binding and activation mechanisms of the AIM2 inflammasome and IFI16 receptor [J]. Immunity, 2012, 36(4): 561-571.

[15]Li T, Jin C, Cristea IM. Human cytomegalovirus tegument protein pUL83 inhibits IFI16-mediated DNA sensing for immune evasion [J]. Cell Host Microbe, 2013, 14(5): 591-599.

[16]Morrone SR, Wang T, Constantoulakis LM, Hooy RM, Delannoy MJ, Sohn J. Cooperative assembly of IFI16 filaments on dsDNA provides insights into host defense strategy [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(1): E62-E71.

[17]Diner BA, Li T, Greco TM, Crow MS, Fuesler JA, Wang J, Cristea IM. The functional interactome of PYHIN immune regulators reveals IFIX is a sensor of viral DNA [J]. Mol Systems Biol, 2015, 11(1): 787. doi: 10.15252/msb.20145808.

[18]Orzalli MH, DeLuca NA, Knipe DM. Nuclear IFI16 induction of IRF-3 signaling during herpesviral infection and degradation of IFI16 by the viral ICP0 protein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(44): E3008-E3017.

[19]Aguirre S, Maestre AM, Pagni S, Patel JR, Savage T, Gutman D, Maringer K, Bernal-Rubio D, Shabman RS, Simon V, Rodriguez-Madoz JR, Mulder LC, Barber GN, Fernandez-Sesma A. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING [J]. PLoS Pathog, 2012, 8(10): e1002934.

[20]Dell′Oste V, Gatti D, Gugliesi F, de Andrea M, Bawadekar M, Lo Cigno I, Biolatti M, Vallino M, Marschall M, Gariglio M, Landolfo S. Innate nuclear sensor IFI16 translocates into the cytoplasm during the early stage of in vitro human cytomegalovirus infection and is entrapped in the egressing virions during the late stage [J]. J Virol, 2014, 88(12): 6970-6982.

[21]Yan N, Regalado-Magdos AD, Stiggelbout B, Lee-Kirsch MA, Lieberman J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to HIV-1 [J]. Nat Immunol, 2010, 11(11): 1005-1013.

[22]Liu Y, Li J, Chen J, Li Y, Wang W, Du X, Song W, Zhang W, Lin L, Yuan Z. Hepatitis B virus polymerase disrupts K63-linked ubiquitination of STING to block innate cytosolic DNA-sensing pathways [J]. J Virol 2015, 89(4): 2287-2300.

[23]Ma Z, Jacobs SR, West JA, Stopford C, Zhang Z, Davis Z, Barber GN, Glaunsinger BA, Dittmer DP, Damania B. Modulation of the cGAS-STING DNA sensing pathway by gamma herpesviruses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(31): E4306-E4315.

[24]Thomsen MK, Nandakumar R, Stadler D, Malo A, Valls RM, Wang F, Reinert LS, Dagns-Hansen F, Hollensen AK, Mikkelsen JG, Protzer U, Paludan SR. Lack of immunological DNA sensing in hepatocytes facilitates hepatitis B virus infection [J]. Hepatology, 2016. doi: 10.1002/hep.28685.

Advances in intracellular DNA sensors of PYHIN family and mechanisms of viral evasion of innate immune responses

WEI Wei1, WANG Sufei1, NI Ming2, YU Bing1

1. Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China；2. Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

The intracellular DNA sensors in host cells recognize viral nucleic acid and activate the innate immunity, then resulting in antiviral effects. However, the viral pathogens have also evolved with appropriate strategies to evade or suppress the innate immune responses. In this review, the characteristics and molecular mechanisms of the immune effects of PYHIN family, one of the DNA sensors in host cells that could recognize viral DNA and activate innate immunity are discussed. The strategies of how viruses escape from the immune surveillance are also summarized.

DNA sensor; PYHIN family; Immune evasion

华中科技大学自主创新研究基金(2016YXMS200)

余冰

Corresponding author. YU Bing, E-mail: yubing@hust.edu.cn

2016-07-23)