亚麻子房整体染色透明、切片技术的优化

曹洪勋，孙宇峰，宋鑫玲，李秋芝，姜籽竹（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319）



亚麻子房整体染色透明、切片技术的优化

曹洪勋，孙宇峰，宋鑫玲，李秋芝，姜籽竹
（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319）

摘要：本文通过整体染色透明技术与石蜡切片技术相结合的方法，结合实验室操作，对亚麻子房石蜡切片方法进行总结，旨在解决因缺少观察设备而无法进行观测和组织观察后样品无法长期保存的缺点，为科研工作者提供方法支持，减少摸索时间。

关键词：石蜡切片；整体染色透明技术；亚麻子房

整体染色透明技术由赫尔提出，适合观察多种植物的胚珠和胚囊［1］。克兰运用另一种透明剂水杨酸甲酯(即冬育油)，其透明效果超过，可用于胚珠、子房的透明。施特利等通过梅氏苏木精明矾染色和冬青油透明观察，这样弥补了单纯用透明法反差太小的缺点，扩大了应用范围。在这基础上，杨弘远提出效果更好的“爱氏苏木精染色一冬育油透明”新程序，对材料有更广泛的适应性［2］。20世纪80年代，中国许多学者以水稻多胚苗为材料，研究无融合生殖，该技术成功应用于多胚苗的胚胎学观察。此外，刘向东等将“爱氏苏木精染色一冬育油透明”实验技术进一步完善，获得更佳的观察效果［3-5］。

虽然整体染色透明技术已经非常成熟，非常便捷，然而这种方法也是有它的局限性的：第一，后期观察时需要微分干涉显微镜，这样一来就把大多数缺少相关设备的人员拒之门外。第二，虽然能够进行观察、照相，然而样品并不能进行长期保存，不利于实验数据的后期积累。所以，仍然有很多人还在进行石蜡切片的制作。众所周知，石蜡制片非常烦琐，这样，优化制片步骤便是当务之急，本文结合整体染色透明技术，对亚麻子房石蜡切片技术进行改进，并阐述操作过程中的关键技术。

1　取材与固定

新鲜采集的亚麻授粉后的子房直接放入FAA固定液中，固定48h后可长时间保存。用50%酒精换洗2次，每次1～2h，继续脱水至70%酒精，剥出子房，按取样不同时期分别放入装有70%酒精的50mL广口试剂瓶，贴上标签。

剥出子房时，将材料倒入装有70%酒精的培养皿中，用解剖刀和镊子取下子房室。如需保存材料，可贮存于4℃冰箱中待用。

2　染色

用铵矾——苏木精染色液染色。操作方法：倒出酒精，加入染色液，染色24h，之后倒出染色液，加入蒸馏水浸洗2次，每次30min。换入自来水2次，每次180min，使材料还蓝，最后经过蒸馏水换入30%酒精中。

3　脱水与透明

材料分别放入50%酒精、70%酒精、85%酒精、95%酒精各1h；之后100%酒精脱水三次，各0.5h；二甲苯与无水乙醇比例为1∶3、1∶1、3∶1各0.5h；二甲苯透明3次，各0.5h。更换脱水剂和透明剂时不用更换样品瓶，只需用纱布包好瓶口，防止样品掉出去就可，这样就可以提高效率，增加样品数量

4　透蜡与包埋

石蜡与二甲苯1∶1 (38℃过夜)→石蜡(58℃1h)3次。将样品从石蜡中取出。

准备足量85℃石蜡，准备包埋盒，盒底垫浸水卫生纸，一次性倒足石蜡，待包埋盒石蜡底部凝固，倒入材料，摆放好位置，确保材料周围无气泡。

5　切片与粘片

用单面刀片修整蜡块，切片机夹子部分蜡块比切片部位要厚，保证切片时蜡块不断裂，蜡块平直、厚度适中、不破碎。使用转动切片机对蜡块进行切片，切片的厚度8～10um，切片角度15°。

贴片时直接用蒸馏水作为粘片剂，把切片浮于水浴锅中进行展片，等展片好了之后，用载玻片捞起切片，吸干多余的水，放于冰箱中保存，切片结束后把切片放在45℃恒温箱中烘干3～4h。

6　脱蜡与制片

脱蜡，经烘干后的切片放入装有二甲苯的染色缸20min，之后经过二甲苯(5min)、二甲苯(5min)、二甲苯与无水乙醇1∶1 (5min)、100%酒精(5min)、95%酒精(5min)、85%酒精(5min)、70%酒精(5min)、50%酒精(5min)、30%酒精(5min)、蒸馏水。晾干后，直接用中性树胶封片。

综上所述，传统石蜡切片法首先对材料进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、复水、封片，操作烦琐，实验周期长，工作量大。整体染色透明切片法是先染后切，免去常规切片后一片片单独染色和分色的繁重工作，可以节省时间、人力和药品，增加样品数量，减少实验次数，且切片不会脱落，染色清晰，特别适用于制作胚囊切片。而且这种方法观察效果也不是整体染色透明法所能比的，观察后材料保存也很方便。

参考文献：

［1］Herr.J.M.,Jr.A new clearing- squash technique for the study of ovule development in angiosperms［J］..Amer,J.Bot.，1971，（58）：785- 790.

［2］杨弘远.用整体染色与透明技术观察胚囊、胚、胚乳和胚状体［J］.植物学报，1986，28(6)：575- 581.

［3］刘向东.水稻多胚苗的初步研究Ⅰ·胚胎学的观察［J］.福建农学院学报，1990，19(2)：131- 137.

［4］刘向东.水稻多胚苗的初步研究Ⅱ·来源与频率［J］.福建农学院学报，1993，22(2)：1- 8，154.

［5］刘向东.高浓度激素喷穗对多胚水稻胚胎发育的形响［J］.中国水稻科学，1993，7(4)：239- 242.

Optimization of Linen Ovary Whole Stain-clearing and Slice Technique

CAO Hong-xun, SUN Yu-feng, SONG Xin-ling, LI Qiu-zhi, JIANG Zi-zhu
(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of sciences, Daqing 163319, China)

Abstract:By using whole stain-clearing technique combined with paraffin section technology, this paper summarized the method of linen ovary paraffin section technology, which aimed at solving the shortcomings that the equipment for observing was lacked and samples could not be preserved long.Furthermore, it provided methodological support and reduced exploration time for the science researchers.

Key words:Paraffin section; Whole stain-clearing technique; Linen ovary

中图分类号：S563.2

文献标志码：A

文章编号：1674-8646（2016）02-0009-02

收稿日期：2015- 12- 16

作者简介：曹洪勋（1982-），男，黑龙江拜泉人，在职研究生，农艺师，从事亚麻遗传育种研究。