发光细菌在水产品安全中的应用研究进展

段效辉，王　颖，曹　鹏，李金庆，鲁　闽，刘　宁

(烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000)



发光细菌在水产品安全中的应用研究进展

段效辉，王颖，曹鹏，李金庆，鲁闽，刘宁

(烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000)

简单介绍了发光细菌检测有害物质的机理及用于有害物质检测的发光细菌种类，综述了发光细菌在水产品安全中的应用研究进展，包括发光细菌检测水产品中抗生素、重金属、甲醛、生物毒素以及急性毒性评价等，并对其应用前景进行了展望。

发光细菌；水产品；有害物质；急性毒性评价

早在17世纪70年代，有研究者发现发光细菌的发光活性可被有害物质抑制[1]。20世纪70年代，研究者们热衷于从海洋环境中分离获得发光细菌，用于水质环境有害物质的检测，这些发光细菌多要求对人体无害且对环境有害物质敏感[2]。此后，发光细菌陆续被用于各种环境污染物质检(监)测和食品综合毒性评价，并建立了以发光细菌发光强度变化为指标的有害物质检测标准，相关的检测试剂盒也陆续研制成功[3-4]。与化学分析法不同，发光细菌检测法可作为有害物质的一个初筛步骤， 如果发光细菌法未检测到有害物质，则不需进行进一步的化学分析。当有多种有害物质同时存在时，发光细菌检测法还可帮助评估该复合污染物的毒力。为此，作者在此简单介绍了发光细菌检测有害物质的机理、用于有害物质检测的发光细菌种类、发光细菌在水产品有害物质检测中的应用以及急性毒性评价等，并对发光细菌检测水产品中有害物质的前景进行了展望。

1　发光细菌检测有害物质的机理

研究认为，发光细菌的发光是由特异性的荧光酶(LE)、还原性的黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子等参与的复杂反应[5-7]。发光细菌与有害物质接触后发光强度会受到抑制，其机理主要分为2种[8]：直接抑制参与发光反应的酶的活性和通过细胞质毒性抑制细胞代谢过程。有害物质可通过单独一种或两种机理同时影响发光细菌的发光强度。基于此，一般将发光细菌检测有害物质或进行急性毒性评价分为直接法和生长法。直接法是将一定浓度的发光细菌直接接种到有害物质溶液中，能立刻检测发光强度的变化；生长法则是将正常发光强度的发光细菌接种到有害物质溶液中，经过一段时间的生长增殖后检测发光强度的变化或在整个生长增殖阶段监测发光强度的变化。

2　用于有害物质检测的发光细菌

目前，用于有害物质检测的发光细菌主要分布于4个属，这些发光细菌都能够在正常的生理条件下发射波长在450～490nm之间的可见荧光。发光细菌与有害物质接触后，其发出的可见荧光强度即发生变化，通过其变化程度，可测定有害物质的浓度或急性毒性[9]。用于有害物质检测的发光细菌有[10-13]：

(1)弧菌属(Vibrio)：哈维氏弧菌(V. harveyi)、美丽弧菌生物型(V.splendidusbiotype Ⅰ)、费氏弧菌(V. fischeri)、火神弧菌(V. logei)、东方弧菌(V. orientalis)、青海弧菌(V.qinghaiensis)、霍乱弧菌(V.cholerae)和地中海弧菌(V. mediterratanei)中的某些菌株。

(2)发光杆菌属(Photobacterium)：明亮发光杆菌(P. phosphoreum)、鳆发光杆菌(P. leiognathi)。

(3)希瓦氏菌属(Shewanella)： 羽田希瓦氏菌(S. hanedai)。

(4)异短杆菌属(Xenorhabdus)：发光异短杆菌(X. luminescens)。

以上菌属多数来自于海洋环境，仅较少量的发光细菌(如发光异短杆菌、青海弧菌、霍乱弧菌)属于淡水发光菌。由于特定的来源和发光特性，发光细菌在水产品及海水环境有害物质的监(检)测中应用日益广泛。

3　发光细菌在水产品安全中的应用

随着水产养殖规模的不断扩大，鱼类疫病不可避免。养殖水域由于渔药的任意使用，环境污染日益严重，对水产品质量的影响也越来越大。在水产品加工、储藏过程中，为了保障水产品卫生水平，一些保鲜剂、消毒剂的不规范使用也可能导致有害物质残留。由于发光细菌对有害物质的生物毒性的高度敏感和易于监测，研究者利用发光细菌建立了水产养殖和水产品加工中常见有害物质(如抗生素、重金属、甲醛、生物毒素等)的检测体系和急性毒性评价方法[14]。

3.1检测水产品中有害物质

3.1.1检测抗生素

抗生素是水产养殖中滥用情况最严重的一类化合物[15]。发光细菌在以氯霉素、四环素为代表的抗生素检测中得到了较好的应用。朱兰兰等[16-17]、王亚群等[18]筛选到适合于水产品中氯霉素检测的发光细菌，并建立了水产品中氯霉素的发光细菌检测体系，该检测体系是基于发光细菌的敏感状态及与氯霉素作用时间建立的，具有灵敏度高、检测限低的优点，且成本低、操作简单快速，摆脱了大型仪器的限制。朱金国等[19]以明亮发光杆菌为指示物，研究了盐酸金霉素、土霉素等四环素族抗生素对明亮发光杆菌T3变种的发光抑制效应，建立了相关的线性方程，灵敏度比传统杯碟法高5倍，具有快速、简便的特点，可快速、灵敏地检测食品中残留抗生素。

3.1.2检测重金属

众所周知，水生生物具有较强的富集重金属的能力，水产品重金属污染已成为消费者关注的焦点[20]。Thomulka等[8]研究了发光细菌检测水中重金属的可行性，并对直接法和生长法的有效性进行评估比较。结果发现，2种方法都可用于水中重金属检测，且都比传统的微生物毒性检测方法敏感，其中，生长法对有害物质的敏感度更高，能更准确地检测有害物质。

3.1.3检测甲醛及生物毒素

束琴霞等[21]利用青海弧菌Q67建立了一种快速检测水产品中甲醛的方法，可在5 min内检测甲醛毒性，为水产品中残留的甲醛现场检测、监管提供了可靠的技术保障。

真菌毒素、细菌毒素是食品中常见生物毒素，采用发光细菌检测水产品中生物毒素残留是发光细菌研究的新方向。刘彩琴等[22]以从深海环境分离得到的发光细菌检测4种真菌毒素，发现发光细菌对黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A敏感度低，但对玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测效果良好[22]。

3.2急性毒性评价

近年来，以发光细菌进行急性毒性评价的研究得到了较快发展，尤其是在环境保护及其处理效果评估等方面得到很好的应用。Girotti等[23]在对被烃类化合物污染的水和土壤进行生物修复后，利用3株海洋发光细菌监测了污染水和土壤的生物毒性变化过程，同时利用气相色谱对污染水和土壤中的烃浓度进行检测，从而证明了发光细菌的急性毒性评价方法的可行性。这一研究给水产品加工措施提供了急性毒性评价手段。

3.2.1对水产品中有害物质的急性毒性评价

若多种有害物质均对发光细菌具有抑制作用，则毒性作用可表现为叠加效应。另外，当外界有害物质浓度发生变化时，其对发光细菌急性毒性也随之发生变化，从而导致发光细菌发光强度的变化。因此，对环境或样品的毒性进行监测或评价也是发光细菌在水产品安全方面的重要应用。

马静等[24]同时研究了几种抗生素和重金属对发光细菌的联合毒性效应。结果发现，几种有害物质两两联合对发光细菌均显示出毒性叠加作用，且具有剂量效应关系。该急性毒性分析方法较传统的动物实验(小鼠法、大鼠法)灵敏度高、耗时短，可满足水产养殖预警及污染突发事件应急分析方面的需求，是利用发光细菌评价急性毒性的重要应用。石颖等[25]以淡水发光细菌青海弧菌Q67为发光指示菌，分析评价了呋喃唑酮、左氧氟沙星等8种兽药对发光细菌的作用规律及急性毒性效应，也是利用发光细菌对有害物质进行急性毒性评价的有意义的尝试。吴淑杭等[26]研究了汞、铬、镉等3种重金属对海水发光细菌明亮发光杆菌的单因子毒性效应和二元重金属混合物的联合毒性效应，揭示了2种重金属共存时生物毒性叠加以及毒性效应的主因子作用。

3.2.2对水产养殖表层沉积物和海洋沉积物的综合毒性监测

水产养殖表层沉积物由饲料、饲用抗生素、动物排泄物、寄生生物、微生物分泌物等多种成分组成，是影响养殖环境安全的重要因素。对表层沉积物的综合毒性进行评价和监测可有效保障水产养殖水域环境安全。许道艳等[27]利用发光细菌监测海洋沉积物综合毒性获得了满意的效果，为水产养殖、海洋环境监测等提供了便捷有效的技术保障。

4　发光细菌检测法存在的问题

发光细菌检测法所具有的方便、快速、低成本等优点使其在水产养殖环境监测、水产品有害物质检测及急性毒性评价等方面备受重视，尤其在水产品质量的现场检测监管以及环境监测方面有着广阔的应用前景。但该法亦存在不足：

(1)特异性不强。首先，由于发光细菌对上千种毒性物质反应灵敏[28]，属于广谱性抑制，因此利用发光细菌检测有害物质的特异性不强。对此，可以从两方面提高该方法的特异性：一是改进样品前处理方法，通过优化其提取条件，提高样品前处理的回收率和提纯率[17]；二是从发光细菌自身基因水平出发，采用现代基因工程技术，提高发光细菌对有害物质的响应特异性。Trang等[29]利用基因工程技术构建了重组发光细菌E.coliDH 5α(pJAMA-arsR)，该发光细菌能够在砷诱导下发出特异性荧光，大大提高其检测特异性。

(2)重现性不佳。由于细胞发光强度差异较大，利用发光细菌进行现场检测时需要使用新鲜培养物，以确保细胞活性。细胞复苏过程会影响细胞活性，如何以合适的细胞活性保存技术保障细胞发光活性的稳定性仍需要进一步研究。目前，细胞活性保存的最佳方法是冷冻干燥法[30-31]。冷冻干燥过程中的保护剂选择、冷冻干燥条件的选择和优化是重点研究内容。

5　结语

水产品的安全离不开水产养殖环境监控、水产品加工措施效果评估以及水产品有害物质检测。针对发光细菌的实际特点，研究者正不断完善其不足，发挥其技术优势，使其在水产品安全应用中的适应性更强，一些以发光细菌为基础的生物传感器也在不断研究、建立和改进。随着现代仪器和光电子技术的发展，发光细菌技术、现代基因工程技术与荧光、紫外等大型分析仪器相结合，将为发光细菌在水产品安全领域的推广应用提供有力保障。

[1]LIU D.A rapid biochemical test for measuring chemical toxicity[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,1981,26(1):145-149.

[2]REPETTO G,JOS A,HAZEN M J,et al.A test battery for the ecotoxicological evaluation of pentachlorophenol[J].ToxicologyinVitro,2001,15(4/5):503-509.

[3]TARKPEA M,HANSSON M,SAMUELSSON B.Comparison of the microtox test with the 96-hr LC50 test for the harpacticoidNitocraspinipes[J].Ecotoxicology Environmental Safety,1986,11(2):127-143.

[4]凌云，赵渝,徐亚同,等.发光细菌法在食品安全性检测中的应用[J].食品与生物技术学报，2005,24(6):106-110.

[5]黄正，王家玲.发光细菌的生理特性及其在环境监测中的应用[J].环境科学，1995,16(3)：87-90.

[6]BALDWIN T O,HASTINGS J W,RILEY P L.Proteolytic inactivation of the luciferase from the luminous marine bacteriumBeneckeaharveyi[J].Journal of Biological Chemistry,1978,253(16):5551-5554.

[7]THOMULKA K W,MCGEE D J,LANGE J H.Use of the bioluminescent bacteriumPhotobacteriumphosphoreumto detect potentially biohazardous materials in water[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,1993,51(4):538-544.

[8]THOMULKA K W,MCGEE D J,LANGE J H.Detection of biohazardous materials in water by measuring bioluminescence reduction with the marine organismVibrioharveyi[J].Journal of Environmental Science and Health Part A,1993,28(9):2153-2166.

[9]KWONG A W,CHAN C Y,RENNEBERG R.Monitoring biodegradable substances with high-molecular content with a microbial sensor[J].Analytical Letters,1998,31(14):2309-2325.

[10]许鸿章，毕可纺，姜旭光.烟台海域一株发光细菌的分离鉴定[J].齐鲁渔业，1990(3):38-40.

[11]HOLT J G,KRIEG N R,SNEATH P H A,et al.Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology(9th edition)[M].Baltimore：Williams & Wilkins,1994:71-377.

[12]杜宗军，王祥红，李海峰，等.发光细菌的研究和应用[J].高技术通讯,2003,13(12)：103-106.

[13]杜宗军，王祥红，李海峰，等.一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究[J].海洋湖沼通报,2003(2)：58-63.

[14]TROTT D,DAWSON J J,KILLHAM K S,et al.Comparative evaluation of a bioluminescent bacterial assay in terrestrial ecotoxicity testing[J].Journal of Environmental Monitoring,2007,9 (1):44-50.

[15]胡梦红.抗生素在水产养殖中的应用、存在的问题及对策[J].水产科技情报,2006,33(5)：217-221.

[16]朱兰兰，王静雪，林洪，等.用于水产品中氯霉素残留检测的发光细菌的筛选[J].高技术通讯，2008,18(7)：754-760.

[17]朱兰兰，林洪，王静雪，等.利用发光细菌进行褐牙鲆中氯霉素残留快速检测的研究[J].食品与发酵工业，2007,33(10)：155-159.

[18]王亚群，王静雪，林洪，等.发光细菌法检测水产品中氯霉素体系建立[J].中国海洋大学学报(自然科学版)，2009,39(1)：66-70.

[19]朱金国，刘红霞.发光细菌检测四环素族抗生素体系的建立[J].中国食品卫生杂志，2005,17(2)：150-153.

[20]汤云.发光细菌在重金属检测中的应用[J].仪器仪表与分析监测,2010(4)：1-3.

[21]束琴霞，张鹏，张林，等.发光细菌法快速检测水发产品中甲醛毒性的研究[J].江苏农业科学，2013,41(11)：329-331.

[22]刘彩琴，范杰，冯琳钕，等.一株发光细菌的分离、鉴定及对霉菌毒素毒性的评价[J].中国食品学报，2012,12(7)：186-191.

[23]GIROTTI S,MAIOLINI E,BOLELLI L,et al.Bioremediation of hydrocarbons contaminated waters and soils:monitoring by luminescent bacteria test[J].International Journal of Environmental Analytical Chemistry，2011，91(9):900-909.

[24]马静，石长华，吴淑英，等.水产养殖鱼药化合物对发光细菌毒性的研究[J].卫生研究，2008,37(3)：291-293.

[25]石颖，丁武，张志超，等.应用青海弧菌评价常见8种兽药的急性毒性[J].西北农业学报，2012,21(6):17-21.

[26]吴淑杭，周德平，徐亚同，等.重金属汞、镉和铬对明亮发光杆菌的生物毒性[J].农业环境科学学报，2011,30(12)：2446-2450.

[27]许道艳，李伟，张芳，等.用发光细菌法监测海洋沉积物综合毒性的可行性研究[J].海洋环境科学，2009,28(5)：570-572.

[28]刘超，姚站馨.发光细菌用于环境检测的研究进展[J].军事医学，2009,33(2):179-182.

[29]TRANG P T,BERG M,VIET P H,et al.Bacterial bioassay for rapid and accurate analysis of arsenic in highly variable groundwater samples[J].Environmental Science & Technology,2005,39(19):7625-7630.

[30]侯静涛，徐芙蓉，王广启，等.对一株海洋发光细菌保存方法的探究[J].环境科学与管理，2008,33(10):167-169.

[31]彭方毅，陈盛珍，姜海蓉,等.发光细菌冷冻干燥条件优化研究与应用[J].环境污染与防治,2010,32(6):8-10.

Research Progress on Luminescent Bacteria in Safety of Aquatic Products

DUAN Xiao-hui,WANG Ying,CAO Peng,LI Jin-qing,LU Min,LIU Ning

(YantaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yantai264000,China)

Themechanismofpoisonouscomponentsdetectionbyluminescentbacteriaandtypesofluminescentbacteriawereintroduced.Researchprogressonluminescentbacteriainsafetyofaquaticproductswasreviewed,includingthedetectionofantibiotics,heavymetals,formaldehyde,andbiotoxinbyluminescentbacteria,andacutetoxicityevaluation.Andtheapplicationprospectwasforecasted.

luminescentbacterium;aquaticproducts;poisonouscomponent;acutetoxicityevaluation

国家质检总局科研项目(2015IK200)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.002

Q 939.1X 830.2

A

1672-5425(2016)10-0008-04

段效辉，王颖，曹鹏，等.发光细菌在水产品安全中的应用研究进展[J].化学与生物工程，2016，33(10)：8-11.