诺如病毒的分子生物学进展

郑 岩，崔立红

1.解放军医学院研究生管理大队，北京100853；2.海军总医院消化内科

综述

诺如病毒的分子生物学进展

郑 岩1，2，崔立红2

1.解放军医学院研究生管理大队，北京100853；2.海军总医院消化内科

诺如病毒（noroviruses，NoVs）是引起人类散发和暴发流行胃肠炎的主要病原体，NoVs的遗传多样性及其在体外难以培养等原因阻碍了对其疫苗和抗病毒药物的研发，尽管对NoVs的研究是一项极具挑战性的工作，然而近期对于NoVs动物模型的研究和体外培养系统的建立使得人们对NoVs的复制、蛋白质功能、重组、致病机制、持续流行均有了不同程度的深入了解，此外，非复制类病毒颗粒疫苗的临床试验也显示了其应用前景。本文总结了上述NoVs分子生物学领域的热点及最新进展。

诺如病毒；分子生物学

诺如病毒（noroviruses，NoVs）是世界范围内各个年龄层急性非细菌性胃肠炎暴发流行的主要病原体［1］，并可长期感染免疫缺陷的患者［2］。据估计，世界范围内病毒性肠胃炎病例50%以上由NoVs引起。在美国，每年有超过2 100万腹泻病例由NoVs引起，NoVs直接导致全球每年90万人次的住院和20万5岁以下儿童的死亡［3］。

NoVs属于杯状病毒家族的4个谱系之一，根据基因特点可分为GⅠ～GⅥ6个基因组［4］，而GⅠ和GⅡ又分别被划分为9个和22个基因型［5］，其中，人类NoVs中的GⅡ.4型是世界范围内流行最为广泛的基因型，自20世纪90年代以来，每隔几年GⅡ.4便会引起一次较大规模的流行，同时很快又有新的变异株出现［6］。Vega等［7］对全美2000–2011年暴发的850例非细菌性腹泻进行研究分析，发现72%的腹泻病例是由于GⅡ.4造成的，经过进一步多变量的分析表明，GⅡ.4感染的患者有着更高的住院率。目前国内的流行趋势为GⅡ.4（2006 b）亚型占主要流行感染株，与此同时还不断出现新的变异亚型。Lu等［8］通过对上海地区2006－2011年NoVs在儿童中流行的研究，发现NoVs住院患儿中75.5%为GⅡ.4株，而门诊NoVs患儿中71.8%为GⅡ.4株；付建光等［9］对苏州市儿童医院2011–2012年采集的腹泻样本进行检测，发现GⅡ.4（2006 b）为优势流行株，同时还检测出GⅡ.4（2010）株的流行与重组株的出现；沈震等［10］对上海地区2012－2013年两处哨点医院的急性腹泻样本进行检测，证实是由GⅡ.4（Sydne 2012变异株）引发了2012年秋冬季NoVs急性胃肠炎的高位流行，以上这些都表明NoVs的基因变异正朝着愈发复杂的方向发展。

1 NoVs的复制

NoVs是一类杯状病毒科单股正链RNA病毒［11］，没有完整包膜，直径约30～45 nm，由80个二聚体构成其衣壳结构［12］，其基因全长约7.5 kb，GC含量大约占45%［13］，其基因组主要包括：（1）5′端非编码区：含有共价蛋白VPg，提供帽子结构；（2）3′端多聚A结构：主要起协同翻译及保证分子结构稳固性的作用；（3）4组开放性阅读框（Open reading frames，ORF）：ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，负责编码非结构蛋白、衣壳蛋白VP1、碱性蛋白VP2等。

由于缺乏稳定的细胞培养体系和动物模型导致人们对NoVs基因复制的研究一度受到限制［14⁃16］，随着分子生物技术的发展，NoVs的复制机制正逐步被阐明。NoVs复制的第一步是从基因组RNA分子上翻译非结构蛋白，研究［17］发现，从NoVs基因组的5′末端去除共价蛋白（VPg）可大幅降低其感染性，且VPg能够与细胞翻译的起始因子相互作用，从而得出结论：VPg在病毒基因组翻译过程中起到起始作用。当非结构蛋白合成后，病毒的RdRp（RNA依赖的RNA聚合酶）在复制复合物的作用下进行基因组复制，利用VPg蛋白质作为引物促使VPg与病毒基因组5′端的共价连接，RdRp的特征已同时证明了NoVs复制的引物依赖性和RNA从头合成的机制。研究发现，鼠NoV.1的非结构蛋白在膜早期和晚期分泌途径中起到连接复制复合物形成的通路作用，另外，复制复合物的形成还涉及细胞骨架网络的参与［18］，基于以上研究，一种通过用新霉素抗性基因替换NoVs ORF2基因而开发的NoVs复制系统已作为一种小分子制剂用于抑制NoVs的复制，目前尚处于动物实验阶段。

从NoVs的哺乳动物复制系统中可提取出亚基因组RNA 5′⁃RACE［19］，亚基因组RNA的5′末端的序列类似于核苷酸基因组RNA（GTAA），且是从第一个复制框AUG ORF2进行转录的。在细胞表达中检测到的VP1是由亚基因组RNA翻译的，而不是以内部起始为基础，这也表明了亚基因组RNA的生物学特性。当基因组RNA与亚基因组RNA共价表达时，NoVs的基因组RNA则可被包装成病毒颗粒，而当亚基因组RNA独自表达时，其基因组RNA则不会被包装成病毒颗粒，这一观察表明，该基因组RNA的包装信号可驻留于ORF1区或RNA包装的非结构蛋白区域内。由于缺乏病毒的培养系统，其感染性不能直接测试，因而所述NoVs基因组中产生的病毒颗粒是否有感染性则是未知的。另外有研究［20］表明，哺乳动物也可在细胞内复制病毒RNA，使其表达并包装成病毒颗粒，因此，缺乏宿主因素支持显然不是限制病毒RNA表达的原因，对缺乏体外适当的复制系统，通过使用反向遗传学表达系统已成功地表达了其他细胞系不易得到复制的这些病毒。

然而，一些关于NoVs复制重要的且尚未解决的问题依然存在［20］，包括动物NoVs研究结果与人类NoVs的相关性；对NoVs基因组翻译和复制所需细胞蛋白功能的详细了解；NoVs亚基因组RNA⁃膜结合复制复合物的形成过程，这些问题的解答尚需一个更加完善的人类NoVs复制系统的建立。此外，病毒感染对宿主细胞的影响，如泛素、细胞质–核分离、细胞死亡和蛋白质转运等问题目前均尚未阐明。

2 NoVs的蛋白质

NoVs的基因组包含4组ORF：ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，4个阅读框部分重叠；ORF1长约5.0 kb，负责编码大型多蛋白［21］，这个多蛋白被病毒编码的蛋白酶切割成至少6个成熟的非结构蛋白，包括P48、3C蛋白酶、VPg、NTPasep41、P22和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）；ORF2（长度约为1.58 kb）与ORF3（长度约为0.82 kb）负责编码NoVs的衣壳蛋白VP1（大小约60 KD）和碱性蛋白VP2（大小约23 KD）［22］，VP1是由一个非常保守的内部壳结构域（S）和一个突出结构域（P）形成二聚体，P域可以进一步细分成P1子域及定位于突出结构表面的P2子域，VP2称为微小结构蛋白，2个结构蛋白VP1和VP2都由亚基因组RNA翻译，ORF1与ORF2之间的重叠长度约为19 kb；对于人类NoVs，第4组ORF与ORF2重叠，且由这种“替代的”ORF4翻译产生蛋白毒力因子1（VF1）［23⁃24］，VF1会参与到病毒的免疫调节。NOV基因组5′端和亚基因组RNA的末端共价连接到小病毒编码蛋白VPg和3′端多聚腺苷酸尾。

由于缺乏培养系统和蛋白检测试剂，NoVs蛋白质表达的研究一直受到限制，但近年研究在了解病毒衣壳蛋白的结构和抗原特性方面得到了显著的进展。通过对ORF2表达的衣壳蛋白进行X射线晶体结构分析表明［25］，该二聚体是由180个亚单位所组成的高级结构单位，这些单位包括P1（残基226⁃278）和P2（残基406⁃520），它们是衣壳蛋白（残基279⁃405）最表浅突出的区域，P1位于P2的两侧，而表面暴露的P2子域能够与HBGA作用并结合在一起，这表明它在结构上应包含特异性决定因子、受体和潜在中和抗体识别位点［26］。杆状病毒重组体表达任一单独的ORF2或ORF2＋3均能产生NoVs的VLPs，表明ORF3蛋白并不是生产VLPs所必需的，但根据ORF3在NoVs基因组中的保守性特点，该蛋白在病毒的生命周期中应具备重要的功能。在天然NoVs颗粒中可检测到ORF3编码的大小为23 KD和35 KD及更高分子量的蛋白，通过ORF3肽抗血清和一些更高分子量的抗NoVs血清的条带检测表明，23 KD蛋白与空病毒体和VLPs相关联，而35 KD蛋白与含RNA的病毒体相关联。另一个有趣的现象是，经过检测NoVs样本含有比NoVs样颗粒更多的ORF3蛋白，它可有助于形成病毒RNA的正确构象，并使其具有特异性。

3 NoVs的重组

NoVs重组是指两个不同病毒株的RNA在复制时交换其基因编码区域（通常是编码衣壳和聚合酶）的过程［27］。RNA重组是病毒进化的主要驱动力之一，它可以通过影响基因组编码区核苷酸的序列进而提高病毒的毒力，同时对NoVs流行病学的研究和疫苗的设计产生严重干扰。目前已在6个天然基因组中发现3个基因组的NoVs存在重组病毒，即GⅠ、GⅡ和GⅢ。2012年的GⅡ.4（Sydney 2012）大流行即为GⅡ.ORF1的毒株重组［28］，聚合酶是重组的驱动因素，目前在NoVs系统中GⅡ.4和GⅡ.b聚合酶是两个应用最普遍的聚合酶，除了GⅡ的重组，其余GⅠ和GⅢ的NoVs重组都是处在或接近ORF1与ORF2重叠的交叉点上［29］。ORF1与ORF2的重叠区域包括亚基因组启动子，其具有各基因组型均十分保守的茎环结构，而这一发现与理论模型一致，这表明病毒的重组应当在聚合酶作用于ORF2的起始二级结构时发生［30］，因此，合成能力差的聚合酶会比其他的RdRps具有更高的切换模板频率。聚合酶在ORF2的起始处进行切换模板的能力是有利的，它可以帮助病毒摆脱进化的瓶颈，这是因为ORF2编码的衣壳蛋白（VP1）中包含病毒的抗原区域，病毒在交换衣壳抗原的过程中能够有机会逃避免疫反应导致的病毒灭绝。

许多RNA病毒已被报道发生了种间交换，其中最显著的是重配（相当于分段基因重组）产生的高致命性禽流感病毒［31］，因此，不同哺乳动物NoVs之间的重组可能导致毒力更强的新NoVs变种的出现，这一点需要引起我们的高度警惕。

4 致病机制

NoVs感染的传播途径为粪口传播［32］，由于NoVs有较强的抵御酸性环境的能力，因而能够通过上消化道定植于人体的肠道上皮细胞内，由病毒RNA作为信使RNA进行复制。最近研究发现，NoVs的感染与宿主的组织血型抗原（histo⁃blood group antigens，HBGAs）直接相关，HBGAs位于肠道上皮细胞表面，可以看作是NoVs的识别受体。NoVs主要通过衣壳蛋白VP1的突出域（P）的末端结合HBGAs［33］，通过对P域的X线晶体分析表明，GⅠ和GⅡ的HBGA结合位点不同：在GⅡNoVs，抗原变异和HBGA结合特异性之间的相互作用是一个主要因素，基因序列变异的累积和结构变化最终导致P域与HBGA结合特异性的变化和抗原漂移［34］，这一理论已被用来解释GⅡ.4基因型会周期性地出现新的变体毒株，并引起暴发流行；而在GⅠNoVs，主要表现在HBGA结合位点附近大量的基因序列变化，这种变化可能会改变HBGA的结合特异性和抗原性，从而促进NoVs的进化。然而，目前此类研究仅限于GⅠNoVs，对于P域结构序列变化是如何改变聚糖结合的特异性仍知之甚少。

NoVs易感染黏膜表面HBGAs具有编码功能的α⁃1，2糖基转移酶（FUT2）阳性表型的个体，那些FUT2酶编码缺陷的阴性个体则能抵抗感染［35］。而最近的流行病学调查显示某些GⅠNoVs的活动性正在增加，一些毒株表现出结合非分泌型HBGAs的能力，GⅠNoVs在这一点类似于GⅡNoVs，表现在P域的序列发生显著变异。HBGA的表达和NoVs的易感性之间的关联已在多个地区的GⅠ和GⅡ（包括GⅡ.4）株上得到证实［36］。然而，其他的酶是否为易感因素，及GⅡ.4病毒在人群中持久流行传播的进化机制尚未完全阐明。

5 GⅡ.4的持续流行与进化

GⅡNoVs一直是NoVs的6个基因组群里的优势流行株，尤其是GⅡ.4［37］，据统计，它造成的爆发性感染事件占全球所有NoVs感染的62%［38］，且还引起了自1995年以来6次影响最为广泛的NoVs大流行（US 1995－1996；Farmington Hills 2002；Hunter 2004；Den Haag 2006 b；New Orleans 2009；Sydney 2012变异株）［39］。

病毒的进化取决于基因突变［40］、复制速率、种群大小和宿主等诸多因素，目前的研究已经证实，宿主HBGAs的不同可以直接影响NoVs毒株在种群内的患病率；尤其是GⅡ.4可以结合到几乎所有的HBGAs，而GⅡ.1和GⅡ.3病毒只能结合有限的几种HBGAs，这也可以解释GⅡ.4病毒发病率较其他基因组群的毒株高。但这种模式仍然是有争议的，尤其对于GⅡNoVs，因为并不是所有的研究均显示HBGAs和临床感染率之间的必然联系。最近对脊髓灰质炎病毒的研究已经表明，增加复制保真度可明显降低病毒的遗传多样性，并导致病毒进化能力和发病率的降低。大多数NoVs基因型的非同步突变几乎都被定位于6种常见的结构部位，且在P2域内的这6个高变区与其他研究中GⅡ.4衣壳的高变位点相一致，GⅡ.7和GⅡ.3病毒分别与GⅡ.4病毒共享2个和4个常见高变位点，通过对高变位点定位发现，这些共有区域很可能是通过中和抗体反应来逃避免疫应答的［41］。除了突变率，复制率也被认为是影响GⅡ.4病毒进化的另一个主要决定因素。高复制率的病毒往往会产生更大的异质性毒株，通过比较发现2006年GⅡ.4大流行毒株的RdRp比重组GⅡ.4的RdRp和GⅡ.4 US 95／96大流行的RdRp均表现出更高的核苷酸引入速率，这可能与病毒RdRp的点突变有关，然而，高复制率并不一定与NoVs的流行病学进化紧密关联，如有着最高复制率的GⅡ.7却有着较低的发病率，由此可见，GⅡ.4株的进化速度是由突变率与复制速度综合作用的结果，同时高速进化也是病毒产生遗传多样性的能力体现。

可以推断的是：GⅡ.4病毒相对于GⅡ.b／GⅡ.3和GⅡ.7病毒而言已达到了其复制率和突变率的平衡，其结果是更利于对环境的适应。因此，加深对NoVs流行病学进化机制的理解对预测将来NoVs大流行十分有意义。

6 抗NoVs药物的研制

目前虽然尚无正式批准的抗病毒药物应用于治疗NoVs感染，但是该领域的研究进步，尤其是GⅠ.1 NoVs载体复制子细胞和NoVs细胞培养系统的进展已使抗NoVs药物的研究成为热点［42］。

通过计算机模拟病毒与宿主细胞的作用过程，越来越多的NoVs蛋白质结构逐渐被阐明，尽管整个NoVs家族的许多结构特征都是保守的，但通过这种途径仍有望获得针对NoVs毒株有效的抑制剂。迄今为止，定位于病毒RdRp和VP1的多种候选抑制剂已在重组蛋白或细胞内进行低浓度的试验［43］。目前在体内测试的唯一候选药物是核苷类似物2′⁃C⁃甲基胞苷（2CMC）［44］，将缺乏Ⅰ型Ⅱ型干扰素受体的老鼠在感染MuNoV⁃1后接受连续7 d（50 mg／kg皮下注射2次／d）的2CMC治疗，结果发现小鼠肠道内病毒的复制明显减少，感染小鼠的腹泻发病率和死亡率明显下降（后由于副作用2CMC被撤回），上述研究表明，2CMC或其他核苷类似物有可能成为治疗NoVs感染或限制病毒传播的有效制剂。目前，加入了Ⅰ型干扰素的去泛素细胞已经在体内测试了其抑制NoVs感染的能力［45⁃46］，WP1130作为去泛素细胞的一个分支，也有望成为一种减少小肠NoVs效价的小分子抑制剂，而IFN⁃α对于NoVs感染的治疗效果已在无菌猪上得到了证实［47］。

目前正在通过各种方法和途径研发有效且安全的NoVs治疗剂，由于单个病毒蛋白常出现的耐药性和病毒变异，未来的研究将有可能扩展到多个抗病毒途径联合治疗的研发。

7 NoVs疫苗的研制

大量研究已经证明包括动物模型和人类NoVs的VP1蛋白在内的VLPs均具有免疫原性［48⁃49］，同时鉴于利用VLPs研发的疫苗已在临床上成功地应用于预防乙肝病毒和人乳头瘤病毒感染［50］，因此目前对NoVs疫苗的开发大多是将VLPs作为免疫原。

研究发现将NoVs VLPs经口或鼻腔给药均能够在受试者体内诱发抗体反应［51］，将GⅠ.1 VLPs配制成能够通过鼻腔内给药的干粉制剂，VLPs通过作用于鼻黏膜上的Toll样受体4（TLR4）和单磷酰脂质A（MLA）使受试者体内产生NoVs IgA和IgG的B细胞记忆应答，此为GⅠ.1 VLPs疫苗。将具有功能性FUT2基因的健康人随机接受安慰剂或GⅠ.1 VLP疫苗，每种疫苗分2次间隔3周经鼻内给药，然后均口服48RT⁃PCR剂量的NoVs（较ID50高10倍），结果显示该疫苗的耐受性良好，且经过酶联免疫测定后，47名疫苗接种者中有33人的血清NoVs特异性的IgA抗体水平出现了≥4倍的增长。此外，所有接种了最高剂量（100 μg）疫苗的受试者均产生了抗原特异性记忆T细胞，因此证明了鼻内疫苗在一定程度上提高了宿主对NoVs感染的短期保护能力。

另外，一种全身给药的二价疫苗也已在人类中试用，将受试者随机分为安慰剂组和二价GⅠ.1／GⅡ.4 VLPs疫苗组［52］，每种疫苗分两次间隔≥28 d肌注给药，28 d后将受试者用4000 RT⁃PCR的异源GⅡ.4株感染，结果显示疫苗接种组（n＝56例）比安慰剂组（n＝48）表现出更低的呕吐和腹泻症状（20%：41.7%，减少52%；P＝0.028）。

然而目前对于生产一种有效的NoVs疫苗仍存在诸多障碍，最近对于NoVs模型系统的研究表明，营养不良可使小鼠消化道黏膜对于NoVs IgA的免疫反应严重降低［53］，通过降低黏膜的抗病毒抗体使得小鼠缺乏抵抗二次打击的免疫保护能力，由此可见对于营养不良宿主的NoVs疫苗的接种方式及效力尚需重视并进一步研究［54⁃56］。而另一个阻碍NoVs疫苗研发重要障碍是病毒家族的遗传异质性，研究显示NoVs缺乏基因型组间的交叉保护。例如，黑猩猩在受到GⅠ.1感染时虽能显示出较强的同型血清抗体反应，但并不能对GⅡ的VLPs形成免疫保护，因此有效的疫苗制剂可能需要最低限度地包括GⅠ和GⅡ的VLPs。

对于NoVs疫苗的开发存在诸多问题亟待解决，鉴于GⅡ.4表现出来的抗原易变性及我们对病毒与宿主反应的认识，有效的疫苗应该是多价的，且可能需要借鉴更新季节性流感病毒疫苗的策略来定期修正NoVs VLPs疫苗［57］。

8 结论

最近的研究工作在NoVs的复制、重组、发病机制及疫苗研发等方面已取得一定进展，但这些工作尚未应用到临床实践。NoVs和宿主免疫之间的相互作用仍是悬而未决的问题，将来的研究领域也许会克服技术上的限制，例如实现在体外培养NoVs，并研发一种直接测量中和抗体的方法，这些都是在为疫苗的开发奠定基础。而诸如遗传宿主的可变性、NoVs基因型组的多样性和病毒持续进化，将继续阻碍和干扰疫苗的研发，直到研制出一种广泛、有效且可持续的疫苗。

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（责任编辑：李 健）

Advances in norovirus molecular biology

ZHENG Yan1，2，CUI Lihong2
1.Department of Management of Postgraduate，Chinese PLA General Hospital＆PLA Medical School，Beijing 100853；2.Department of Gastroenterology，Navy General Hospital，China

Human noroviruses（NoVs）are a major cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide，and they can chronically infect immunocompromised patients.Effective vaccines and antivirals have been hindered by the un⁃cultivable nature and extreme genetic diversity of human NoVs.Although they remain to be a particularly challenging pathogen to study，recent advances in NoVs animal models and in vitro cultivation systems have led to an increased un⁃derstanding of replication and protein function，restructuring，pathogenesis，and continued popularity.Furthermore，clinical trials of vaccines consisting of nonreplicating virus⁃like particles have shown promise.In this review，these recent advances and controversies were summarized in the field.

Norovirus；Molecular biology

R512.5

A

1006－5709（2016）12－1475－06

2016⁃01⁃26

10.3969／j.issn.1006⁃5709.2016.12.050

军队后勤科研计划重点项目（BHJ14L010）

郑岩，在读硕士研究生，主治医师，研究方向：肠内营养微生态与消化系疾病。E⁃mail：12278342＠qq.com

崔立红，博士，主任医师，教授，研究方向：功能性胃肠疾病、肠内营养微生态与消化系疾病、内窥镜早癌诊治。E⁃mail：luckycui861＠sina.com