细菌耐多药外排泵的研究进展

陈小燕，潘珏

复旦大学附属中山医院呼吸内科，上海 200032

·综述·

细菌耐多药外排泵的研究进展

陈小燕，潘珏

复旦大学附属中山医院呼吸内科，上海 200032

摘要：近年来，由于抗生素的不合理及广泛使用，全球多重耐药菌和广泛耐药菌不断出现。关于细菌耐药机制中外排泵及生物膜形成的研究越来越受关注。研究发现，外排泵与生物膜形成有密切联系，不同细菌的不同外排泵对生物膜形成的影响各异，而生物膜形成又影响外排泵基因表达。本文就细菌耐多药外排泵的研究进展进行综述。

关键词：耐多药外排泵；生物膜形成；外膜因子

近年来，由于抗生素的不合理及广泛使用，全球多重耐药和广泛耐药细菌不断出现。2014年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示，细菌耐药呈增长趋势，特别是革兰阴性菌，其中不动杆菌属(鲍曼不动杆菌占93.0%)对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.4%和66.7%[1]。目前，关于细菌耐药性的研究主要包括细菌灭活酶产生、靶位改变、外膜通透性改变、主动流出系统(即细菌外排泵)、耐药基因转移及生物膜形成等。其中，细菌外排泵在介导细菌耐多药、细菌毒力及生物膜形成中的作用逐渐受到关注，但尚不清楚细菌外排泵与细菌生物膜形成之间的内在联系。细菌耐药外排泵的广泛分布与功能重叠暗示其尚有介导耐药以外的其他重要生物学功能。由此，本文就细菌耐药外排泵的分类及其与生物膜形成的相互影响进行综述。

1细菌耐药外排泵的分类

根据超微结构、转运机制、氨基酸序列同源性等，目前抗菌药物耐药相关外排泵可分为五大家族：主要易化子超家族(major facilitation superfamily，MFS)、多药和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion，MATE)家族、ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族、耐药结节分化(resistance-nodulation-cell division，RND)家族和小多重耐药(small multidrug resistance，SMR)家族〔属于药物/代谢物转运蛋白(drug/metabolite transporter，DMT)超家族〕[2]。这5类外排泵的主要区别如下。①结构组成：RND家族主要以三聚体形式转运底物，RND外排泵通常由染色体基因编码，其结构由膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)、RND转运蛋白、外膜因子(outer membrane factor，OMF)3部分组成，以三聚体形式横跨于细菌内外膜之间。其中MFP使细菌内外膜结合紧密，结构稳定；RND转运蛋白具有识别底物和将底物转出细胞膜的功能；OMF位于细胞外膜，具有孔道蛋白的作用。这种三聚体转运复合体具备高效转运功能，同时由于外膜屏障的存在，泵出菌体外的底物不易再次返回菌体内。有研究发现，破坏OMF产生的效果与灭活泵效果无统计学差异，表明外膜通透屏障与RND的作用密不可分[3-5]；而ABC、SMR、 MATE家族和MFS则以单聚体形式横跨细菌内膜。这种单体泵往往在将底物泵至周浆间隙后，部分药物因具有相对亲脂性可再次经内膜脂质双分子层扩散入细菌胞内发挥作用，因此是一种低效率的耐药泵。②细菌分布：革兰阳性菌主要耐药外排泵是ABC家族[6]，革兰阴性菌的主要耐药外排泵是RND家族[7]。除RND家族只存在于革兰阴性菌外，其他4个家族(MFS、ABC、SMR、MATE)广泛分布于革兰阳性菌和革兰阴性菌[2]。③外排泵动力：ABC家族以ATP供能；SMR、MATE、RND家族和MFS则以质子跨膜驱动力为外排动力。④外排底物种类：ABC和SMR家族外排泵的外排底物种类较少；MATE 和RND家族外排泵的外排底物包括多种抗菌药物、消毒剂、染料等。

2耐药外排泵在生物膜形成和生物膜介导耐药中的作用

生物膜形成是临床上定植菌难以清除的重要原因，生物膜形成后细菌耐药性强于单个细菌(浮游细菌)。目前认为，细菌生物膜相关的耐药机制可能与细菌生物膜诱导低生长率、改变代谢与生理、产生细胞外生物膜基质和上调应激反应能力有关[8-9]。生物形成过程包括3个阶段：初始黏附、成熟、形成分菌落[10]。此过程涉及多种环境刺激因子、特定基因和多种调节通路。细菌生物膜形成有赖于生物膜形成相关基因表达，从而增加菌毛数量、菌体外基质纤维等，与相邻细菌相互黏附构成稳固的三维立体膜结构，提高细菌耐药性。因此，外排泵介导细菌耐药与生物膜介导细菌耐药之间可能存在密不可分的关系。

2.1耐药外排泵表达影响生物膜形成

在鼠伤寒沙门菌耐药机制研究中，分别敲除或抑制9种外排泵〔AcrAB(AcrA 除外)、AcrD、AcrEF、MdtABC、MdsABC、EmrAB、MdfA、MdtK、MacAB〕和TolC，生物膜形成能力下降，但不影响细菌生长曲线。将携带外排泵基因的质粒导入缺陷突变菌株后，又能恢复正常生物膜形成能力。刚果红染色试验中观察到curli菌毛在外排泵敲除菌株中明显减少，但菌体外基质纤维素未减少。反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)显示，9种外排泵和tolC敲除突变株中，所有菌株csgB基因(curli菌毛合成相关基因)表达均显著下调，9种突变株csgD表达显著下调，acrB或tolC突变株的菌毛合成相关基因csgA、csgB、csgD、csgE、csgF、csgG均下调。前面提到的acrA基因敲除例外，但acrA基因缺失突变后可导致细菌多耐药性、黏附力、侵袭能力下降。acrA突变株与acrB或tolC突变株的主要差别正是curli基因在acrA突变株中正常表达。综上所述，推测鼠伤寒沙门菌耐药外排泵可能改变curli菌毛合成相关基因表达水平，减少curli菌毛产生，影响细菌形成成熟的生物膜[11-12]。然而，最近有研究证明鼠伤寒沙门菌的acrAB或acrB基因敲除后并不影响细菌生物膜的形成；给予氯霉素处理后，突变株和野生株的生物膜形成才受影响[13]。这两个相矛盾的研究结果提示，存在其他调控因子影响外排泵对生物膜形成的作用，因此如何更好地将外排泵抑制剂与抗生素联合应用于耐药菌感染的治疗还需进一步研究。在鲍曼不动杆菌生物膜形成机制研究中发现，上调RND家族外排泵adeG基因表达可诱导生物膜形成。AdeFGH外排泵参与鲍曼不动杆菌的生物膜形成，且abaI基因上调与adeG基因具有协同作用，可进一步促进生物膜形成。推测其分子机制为adeFGH基因过表达加速细菌群体感应分子〔酰化高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone，AHL)〕转运至菌体外，菌体外AHL浓度不断增加，反渗入菌体胞质形成AbaR-AHL复合体，后者通过abaR(细菌群体感应转录调控子)激活abaI基因，使AHL合成增加，继续通过过表达的外排泵泵出菌体外。如此周而复始，加强细菌间相互作用，促进生物膜形成[14]。此外，上调鲍曼不动杆菌多种RND泵、外膜蛋白 OmpA 和CarO 可促进生物膜形成。OmpA 和CarO可能作为细菌主要的L-组氨酸摄入通道，影响组氨酸代谢而促进生物膜形成[15]；而abeD缺失突变后不影响生物膜形成[16]。在大肠埃希菌耐药机制研究中，肠集聚性大肠埃希菌tolC缺失突变后可能通过改变Mg2+转运，在转录后修饰水平降低蛋白疏水性，提高其聚集性和生物膜形成能力；也可能通过某种TolC介导外排的体液因子(推测其为存在于AAF菌毛疏水蛋白表面的一种相对分子质量为38 000的蛋白)，调节AAF菌毛疏水蛋白功能及表达量，提高其聚集性和生物膜形成能力。至于是否通过上述群体感应调控机制及TolC分泌抗原Ag43改变生物膜形成能力，还需进一步证实[17]。将大肠埃希菌RND家族(acrAB、acrD、acrEF、mdtABC、mdtEF)、MFS(emrAB、emrD、emrKY)、SMR家族(emrE)和ABC家族(macAB)的外排泵基因分别敲除后，生物膜形成能力均降低[18]。在大肠埃希菌IncX1大接合质粒中，编码OqxAB泵(RND家族)和Ⅲ型菌毛(mrkABCDF)的基因共同存在于复合转座子(Tn6010和Tn6011)中，因此外排泵可影响菌毛表达，改变生物膜形成能力[19]。敲除嗜麦芽窄食单胞菌macABC基因后，生物膜形成减少50%[20]。在铜绿假单胞菌培养基中加入外排泵抑制剂PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide)和铁离子螯合剂，发现生物膜形成减少[21]。脆弱类杆菌在胆盐诱导下高表达RND外排泵基因，促进生物膜形成[22]。尽管许多研究证明上调外排泵表达可促进生物膜形成，但Yoon等在鲍曼不动杆菌耐药机制研究中发现，过表达RND家族AdeABC和AdeIJK后细菌膜复合体结构改变，从而降低细菌的生物膜形成率[23]。因此，不同细菌外排泵对生物膜形成的影响不同。在这些突变株中观察到的外排泵对生物膜形成的影响可能是基于一些信号分子表达水平的改变，而这些信号分子很可能成为去除耐药菌的靶分子，值得继续研究。

2.2耐药外排泵诱导浮游细菌耐药，在生物膜包被细菌中与生物膜协同发挥作用

铜绿假单胞菌本身具有较高的生物膜介导耐药能力，但体外研究发现其外排泵mexAB-oprM基因敲除后，可增强多黏菌素对生物膜包被细菌的杀伤力。这是通过MexAB-OprM泵和Pmr介导的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)修饰等多种机制改变生物膜包被细菌的多黏菌素代谢活性及多菌株共存能力，从而增强生物膜包被细菌对多黏菌素的耐药性[24]。对氧氟沙星耐药主要由MexAB-OprM泵介导，生物膜则依赖MexAB-OprM泵而稍提高其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。这些菌株能在膜攻击因子(多黏菌素和氯己定)作用下存活，不仅与MexAB-OprM 泵有关，MexCD-OprJ泵和MuxABC-OpmB泵也发挥重要作用。但研究并未证实AcrAB泵或MexAB-OprM泵可进一步提高生物膜介导的环丙沙星耐药性。Mah等发现铜绿假单胞菌外排泵缺失突变株通过MexAB-OprM外排泵下调表达而抑制生物膜的特异耐药机制，可提高对大环内酯类(阿奇霉素)的敏感性，因此MexAB-OprM外排泵对生物膜介导耐药有协同作用[9]。在生物膜包被的铜绿假单胞菌中敲除OpmL-ABC-HlyD外排泵基因时，生物膜包被细菌对氨基糖苷类(妥布霉素)和喹诺酮类(环丙沙星)的敏感性增加。以上研究表明，生物膜既存在依赖外排泵的耐药机制，也存在独立而特异的耐药机制。外排泵可进一步增强已形成的生物膜介导细菌耐药。2.3耐药外排泵依赖生物膜形成而诱导表达，生物膜形成相关基因同时被诱导表达研究发现，SagS和BrlR调控蛋白为生物膜介导耐药所必需[25-26]。两者结合可激活c-di-GMP第二信使[27]，它是氨基糖苷类诱导生物膜形成和耐药的相关分子[28]。SagS与其他3个二聚体调控蛋白——BfiRS(调控生物膜初始黏附)、BfmRS(调控生物膜成熟)和MifRS(调控分菌落形成)在生物膜形成过程中协同发挥作用[24]。BrlR作为mexAB-oprM和mexEF-oprN基因的转录激活因子，仅在生物膜形成细胞中表达[23]。brlR基因不能被外排泵底物诱导表达，与其他MerR型调控子(如BltR和BmrR)在外排泵底物诱导下调控耐药不同[29]。灭活SagS可减少 c-di-GMP，因此c-di-GMP受SagS的正调控[25]。c-di-GMP进一步正调控BrlR，增强BrlR与启动子(BrlR靶基因)的结合性[27, 30]。SagS、c-di-GMP、BrlR形成耐药性转换中的重要信号网络，也为MexAB-OprM和MexEF-OprN泵基因高表达所必需(这两个泵可提高生物膜包被细菌和浮游细菌的耐药性)。有趣的是，浮游菌体c-di-GMP、BrlR、MexA和MexE高表达也可增加耐药性[25]。灭活胞质外功能σ因子(extracytoplasmic function σ factor) ECF-10可促进恶臭假单胞菌的生物膜形成，上调TtgABC耐药泵[31]。在体外，利用荧光标记技术和共聚焦显微镜动态检测mexAB-oprM基因在生物膜形成中的表达量，结果显示暴露于多黏菌素后，直接接触多黏菌素部位的细菌mexAB-oprM基因表达量未增加，而包绕多黏菌素生物膜外围的细菌mexAB-oprM基因上调表达，表明外排泵在成熟生物膜这样一个微环境中更易被诱导表达。Mah等也证实生物膜包被的铜绿假单胞菌多种外排泵被诱导表达，包括MexCD-OprJ和MexXY[9]。研究发现，铜绿假单胞菌A1875-PA1877编码的外排泵在生物膜介导的环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素特异耐药中起重要作用[32]。大肠埃希菌UPEC 和K-12菌株中编码解旋酶样蛋白的rapA基因缺失突变后，其生物膜结构正常但耐药性下降，可提高对青霉素G的敏感性，而对浮游细菌的耐药性无影响。这种突变株中有22种基因下调表达，包括编码MDR外排泵YhcQ的基因。yhcQ基因在rapA突变株中低水平表达，表明RapA诱导生物膜形成的同时可提高yhcQ基因表达水平[33]。

综上所述，外排泵在生物膜形成及生物膜介导耐药机制中起重要作用。临床实践中，细菌在医疗器械如呼吸机和各种体内植入物表面、感染部位形成生物膜一直是抗生素治疗的难题。因此，研究细菌生物膜介导耐药、外排泵介导耐药及细菌生物膜与外排泵的内在联系非常必要。细菌外排泵不仅与细菌耐药性有关，还与细菌生物膜形成息息相关。耐药外排泵的上调或下调表达均可能改变细菌生物膜的形成。反之，形成生物膜的细菌又通过外排泵依赖和非依赖途径介导耐药。但并非所有外排泵抑制剂均对生物膜形成有抑制作用。外排泵通过何种信号分子而改变细菌生物膜形成能力至今尚不清楚，有待进一步研究。

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Research progress on bacterial multidrug efflux pumps and biofilm formation

CHEN Xiaoyan, PAN Jue

Department of Respiration, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Multidrug-resistant bacteria and pan-drug resistant bacteria are major clinical concerns associated with misuse and abuse of antibiotics. The multidrug efflux pumps and biofilm formation, two mechanisms of drug resistance, are catching more attentions recently. Studies demonstrated that some efflux pumps in different bacteria influence biofilm formation, which in turn changes the gene expression of efflux pumps, indicating a possible interaction between multidrug efflux pumps and biofilm formation.

Key words:Multidrug efflux pump; Biofilm formation; Outer membrane factor

基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科研课题(201440394)

通信作者：潘珏

Corresponding author. PAN Jue, E-mail: jue.pan@yahoo.com

(收稿日期：2016-02-19)