干细胞治疗薄型子宫内膜的研究进展

余璐萍，刘英



·综述·

干细胞治疗薄型子宫内膜的研究进展

余璐萍，刘英△

在辅助生殖技术中，子宫内膜厚度可以反映内膜功能状态，薄型子宫内膜是指子宫内膜厚度不足以获得胚胎着床及临床妊娠。虽然临床对薄型子宫内膜治疗的方式较多，但总体治疗效果欠佳。干细胞因具有多向分化和自我更新的潜能而展现出广阔的发展前景，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞，随着对干细胞研究的深入，目前有研究诱导干细胞向子宫内膜细胞定向分化并增生，以促进子宫内膜生长，进而用于治疗薄型子宫内膜。现主要就骨髓间质干细胞（BMSCs）、子宫内膜干细胞（EDSCs）、人胚胎干细胞（hESCs）及人脐带华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）在薄型子宫内膜治疗的研究进展以及这4种细胞用于临床治疗的优缺点进行综述。

薄型子宫内膜；子宫内膜；干细胞；干细胞移植；治疗

【Abstract】In assisted reproductive technology（ART），the endometrial thickness is a common index of the endometrial function.When the endometrium is too thin to suit for embryonic implantation and clinical pregnancy，it is defined as the thin endometrium.Although there are many treatments for thin endometrium，the effects are not satisfied.Stem cells，including embryonic stem cells（ES），adult stem cells and induced pluripotent stem cells （iPS），with the ability of self-renewal and differentiation，have been applied inmany clinical trials.Studies showed that stem cells can be induced to endometrial cells，and that stem cells can promote the endometrial growth of endometrium，which means that stem cellsmay be used to treat thin endometrium.In this review，we discussed the research progress on the application of bonemarrow mesenchymal stem cells（BMSCs），endometrial stem cells （EDSCs），human embryonic stem cells（hESCs）and human wharton′s jellymesenchymal stem cells（WJ-MSCs）in the treatment of thin endometrium，and compared their advantages and disadvantages.

【Keywords】Thin endometrium；Endometrium；Stem cells；Stem cell transplantation；Therapy

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：331-334）

基金项目：国家自然科学基金（81471520），国家留学基金项目（20119 11033），北京市自然科学基金（5122015），北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目（2014-3-075）

作者单位：100026北京，首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科通信作者：刘英，E-mail：yingliubj@hotmail.com

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审校者

子宫内膜过薄是导致妇女不孕和宫腔粘连的常见原因之一，目前，国际上对薄型子宫内膜的评价标准尚未统一，最新的一项Meta分析认为子宫内膜厚度超过7mm的患者妊娠率明显高于不足7mm者［1］。薄型子宫内膜的病因尚未明确，有研究发现，薄型子宫内膜形成主要与子宫内膜雌、孕激素效能下降［2］、宫腔刮宫等操作史［3］、长期（≥5年）服用复方口服避孕药等有关［4］。Miwa等［5］首次提出薄型子宫内膜的发生机制为血管内皮生长因子（VEGF）低表达、血流高阻力和腺上皮生长缓慢。其主要临床表现为月经周期正常，但经量过少（小于30mL）和不孕。薄型子宫内膜的治疗方法主要有药物治疗、搔刮刺激治疗、宫腔内注射粒细胞集落刺激因子治疗等。虽然薄型子宫内膜的治疗方式较多，但总体治疗效果欠佳。

干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞群体，按发生学来源可分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、成体干细胞（adultstem cells，ASCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。因干细胞在再生医学上突显出其独特的优势而快速发展，已有研究报道用干细胞成功修复子宫内膜并妊娠［6］。现从干细胞的角度总结薄型子宫内膜治疗的研究进展，为薄型子宫内膜的治疗提供新思路。

1　骨髓间充质干细胞（bonemarrow m esenchymal stem cells，BMSCs）

1.1BMSCs应用于子宫内膜修复的研究现状BMSCs是骨髓中除造血干细胞外，另一类具有多项分化潜能的细胞群体，其在特定的诱导条件下可以向3个胚层的组织细胞分化。

Du等［7］研究发现子宫缺血/再灌注损伤导致子宫内膜可募集到更多BMSCs，其数量达未损伤时的2倍，参与损伤后子宫内膜的修复，但在子宫内膜生理周期中并无此现象，这为将BMSCs用于薄型子宫内膜的治疗提供了可能。Zhao等［8］将BMSCs注入薄型子宫内膜的SD大鼠宫腔，发现大鼠子宫内膜显著增厚，推测BMSCs在子宫腔可直接分化为子宫内膜细胞，或通过分泌细胞因子和免疫调节作用刺激子宫内膜细胞增殖。该研究的另一个新发现是移植BMSCs后，整合素αγβ3、白血病抑制因子（LIF）的含量与正常鼠的含量相近，整合素和LIF是子宫内膜容受性的标志物，对胚胎着床有重要作用，提示干细胞灌注不仅提高了子宫内膜的再生能力，还提高了内膜的容受性。

以上研究表明，BMSCs直接输注薄型子宫内膜的宫腔促进子宫内膜细胞再生，为治疗薄型子宫内膜提供了新思路。

1.2BMSCs应用于薄型子宫内膜治疗的优越性和局限性BMSCs是最早发现可分化为子宫内膜细胞的多能间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其可从骨髓中成功分离，较易在体外培养、诱导和扩增，临床应用无免疫排斥反应和伦理问题。但其获取过程有创，可能会造成机体的伤害及增加感染的风险；同时所含MSCs数量较少，只占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%；分化潜能也随年龄增长而显著降低，这些缺点使其在薄型子宫内膜治疗的应用受到了限制。

2　子宫内膜干细胞（endometrialstem cells，EDSCs）

2.1EDSCs的存在依据和分离鉴定方法早在1978年Prianishnikov［9］就提出可能存在EDSCs。子宫内膜具有再生修复功能，发生在经期、分娩、流产和其他原因造成的内膜损伤后。子宫内膜还具有远处转移和种植等类似于肿瘤的生物学行为，子宫内膜异位症就提示了EDSCs的存在。目前用于分离鉴定EDSCs的方法如下。

2.1.1集落生成法（colony-formingunit，CFU）CFU

是最经典的方法，通过制备单细胞悬液，以极低密度种植后形成克隆性集落，可用于分离与鉴定EDSCs［10］。

2.1.2标签滞留细胞群法（label retaining cells， LRCs）将5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）染料注射入小鼠体内，在有丝分裂的DNA复制期，BrdU染料与DNA发生融合，一段时间后，已分化细胞因代谢快，BrdU染料逐渐消失，而未分化干细胞仍稳定保留BrdU，采用组织切片化学染色原理对EDSCs进行分离鉴定及空间定位［11］。

2.1.3Hoechst33342——SP法是目前最为常用的方法，Hoechst33342是一种通过三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette transporter sub-family Gmember 2，ABCG2）转运的DNA染料。侧群细胞（SP细胞）通过ABCG2可快速排除DNA染料Hoechst33342，而呈现着色较浅甚至不着色，通过流式细胞仪可将其分选出来［12］。

2.1.4细胞表面标记筛选法正常子宫内膜或高或低表达13种作为干细胞标记的特性基因（SOXZ，SOX15，ERAS，SALL4，OCT4，NANOG，UTFI，DPPAZ，BMI1，GDF3，ZFP42，KLF4，TCLI）［13］以及目前新发现的W5C5［14］，可用于分选子宫内膜干细胞群。

以上研究均提示子宫内膜组织中可能存在干细胞，但是通过以上4种方法并没有筛选出完全重叠的细胞群。

2.2EDSCs应用于子宫内膜修复的研究现状EDSCs作为一种ASCs，已被证实具有高增殖潜力和多向分化潜力。

Masuda等［15］将人类子宫内膜上皮和基质混合细胞群移植到NOD/SCID小鼠肾包膜下进行异种移植研究，混合细胞群能在小鼠体内存活并增殖，再生出含有腺体和基质的子宫内膜样结构，并随着激素变化而发生增生、分化、脱落的周期性改变。混合细胞群能分化并生长出血管，侵入宿主的脉管系统而建立血管网。证实部分子宫内膜细胞在异种移植体系中能够自我更新，具有高增殖能力和一定的分化潜力，符合干细胞的特性。

有报道通过研究子宫内膜SP细胞凋亡模式和大鼠子宫内膜缺血模型证实：在缺血缺氧的条件下，SP细胞的端粒酶、c-kit以及pou5fl表达降低，而Caspase-3（促进细胞凋亡）表达增加，细胞凋亡增多［16］。推测在缺血条件下大鼠子宫内膜变薄与SP细胞的凋亡增加有关，据此认为在无法通过药物、手术等改善子宫内膜血流的情况下，通过增强EDSCs活性，增加其数量或减少凋亡可治疗薄型子宫内膜。

鉴于ASCs在调节组织稳态和再生中的重要作用，推测EDSCs位置、数量或功能异常可能是子宫内膜异常的原因［17］。EDSCs缺乏可能引起子宫内膜组织的缺乏，从而导致宫腔粘连［18］；EDSCs活性减弱可能引起子宫内膜过薄（小于7mm）而无法支持胚胎着床。据此新观点，EDSCs在细胞水平治疗子宫内膜功能不良具有可行性［19］。

2.3EDSCs应用于薄型子宫内膜治疗的可能性和局限性EDSCs是一种ASCs，致瘤风险低，操作简单，取材便利，可从月经血、切除的子宫内膜及蜕膜［20］等很多组织中提取、纯化、培养，在良好的临床指导下可大规模生产，因此，EDSCs是理想的种子细胞，可用于治疗因宫腔粘连、子宫内膜过薄、生长不良等导致的胚胎无法着床或子宫内膜容受性差等引起的不孕［17］。

但是EDSCs用于治疗薄型子宫内膜还存在以下问题：①由于缺乏EDSCs特异性表面标志物造成EDSCs分离困难；②子宫内膜有几种类型的干/祖细胞仍待确定，它们如何分化成不同表型和功能的细胞，以及各类型之间是否有层次关系并不明确；③EDSCs在临床中的应用可能存在潜在风险，根据目前的临床观察及基础研究，EDSCs数量、定位以及分化能力的改变均有可能引发子宫内膜疾病，如子宫内膜异位症、子宫内膜癌等。

3人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）

3.1hESCs的研究进展hESCs是人体内最原始的细胞，由原始生殖细胞（primordialgerm cells，PGCs）或者囊胚的内细胞团（inner cellmass，ICM）分离，具有发育全能性，在合适的培养条件下，在体内外均可以被诱导分化成各种类型的细胞，如神经细胞、胰岛分泌细胞、生殖细胞、心肌细胞［21］等。这一特性使其成为学者们的研究热点。

目前，hESCs诱导分化的方法有：①添加法，即向细胞培养基中添加细胞分化所必需的因子，如17β-雌二醇、维生素C、地塞米松等，该法操作简便；②共培养法，即与目标细胞共培养营造目标细胞生长微环境，如Park等［22］将hESCs与PGCs在体外共培养后，显著促进hESCs分化为PGCs；③转基因法，通过基因转染技术使与分化相关的关键基因在干细胞中高表达或者低表达，从而调控细胞分化。

Yu等［23］通过实验证实，hESCs与小鼠子宫内膜基质细胞共培养，可诱导其分化为子宫内膜样上皮，其表面可表达雌、孕激素受体、细胞角蛋白、上皮细胞连接分子EPCAM、CA125、β-微管蛋白，上述实验证实了hESCs可以向子宫内膜样细胞分化，为

利用hESCs的分化全能性，诱导其向子宫内膜方向分化，以解决薄型子宫内膜这一临床问题提供实验依据。目前认为干细胞在增殖和分化成女性生殖系统过程中，Wnt4、5a、7a等基因发挥重要作用［24］。

3.2hESCs应用于薄型子宫内膜治疗的可能性和局限性hESCs具有发育全能性，更易于诱导分化。目前，限制hESCs应用于再生医学有以下几方面：①成瘤性，组织器官中未分化干细胞形成畸胎瘤是影响实验成功的障碍，Nussbaum等［25］将ESCs（5×105）移植到心肌梗死小鼠模型的梗死心肌及边缘区，3周后处死小鼠发现在ESCs注射区域形成畸胎瘤；②使用hESCs存在伦理问题，但已有学者利用常规体外受精/胞浆内单精子注射（IVF/ICSI）周期中因形态学评分差而不适合用于移植的胚胎，成功建立起hESC系［26］。

4　人脐带华通胶间充质干细胞（human wharton’s jellymesenchymalstem cell，W J-MSCs）

4.1W J-MSCs的研究进展WJ-MSCs是一种ASCs。人脐带由3部分构成：羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华通胶的黏液结缔组织［27］，WJ-MSCs是指从脐带华通胶中分离培养出的一种成纤维样的MSCs。Boroujeni等［28］将WJ-MSCs进行体外培养并成功诱导，使其分化形成类胰岛β细胞，并可分泌胰岛素；Yang等［29］将WJ-MSCs移植到肝损伤模型的小鼠中，小鼠的肝功能改善，生存率提高。Yang等［30］初步证实，WJ-MSCs对米非司酮诱导的子宫内膜间质细胞损伤具有一定的修复作用，显示WJ-MSCs可以修复并保护受损的子宫内膜，从子宫内膜的功能学角度看，还可以改善子宫内膜容受性，有利于胚胎着床，为WJ-MSCs应用于薄型子宫内膜治疗提供了依据。

4.2W J-MSCs应用于薄型子宫内膜治疗的可能性和局限性WJ-MSCs作为ASCs可修复多种组织器官的损伤，应用于薄型子宫内膜治疗具有以下优势：①取材容易、无创、来源广泛，脐带是目前未被利用的组织，可从脐带中分离出大量具有多向分化潜能的WJ-MSCs，且属于较年轻的细胞类型，受环境和外界因素引起的DNA损伤较小；②使用WJMSCs不涉及伦理问题；③脐带来源的WJ-MSCs含有较长的端粒酶，具有较强的自我更新和增殖活性；④脐带来源的WJ-MSCs免疫原性低，并且无致瘤性；⑤易于转染外源基因，如将胰岛素基因转染至WJ-MSCs中，再将其移植入Ⅰ型糖尿病小鼠中，发现WJ-MSCs可以分泌胰岛素。因此，WJ-MSCs被认为是新型的种子细胞，近年来成为干细胞领域的研究热点。

5　结语与展望

子宫是维持女性生理功能和生育能力的重要器官，子宫内膜在胚胎着床过程中发挥着重要的作用，因此，适当的子宫内膜厚度及正常的子宫内膜容受性是辅助生殖技术助孕成功的关键。子宫内膜过薄可阻碍胚胎在子宫内膜着床和发育，无法获得临床妊娠，目前尚无有效的治疗方法。随着干细胞研究的深入，基于干细胞修复与再生能力的再生医学有望成为继药物治疗、手术治疗后的第3种治疗途径，将干细胞诱导分化为子宫内膜细胞，为子宫内膜过薄的治疗提供新的指导方向及理论基础。

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［本文编辑王昕］

Outlook of Stem Cells for the Treatment of Thin Endometrium

Y
U Lu-ping，LIU Ying.Department of Reproductive Medicine，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China

LIU Ying，E-mail：yingliubj@hotmail.com

（2016-03-04）