卵泡发育不均时优势卵泡排出后继续黄体期促排的可行性

金武敏，赵军招，王佩玉，余蓉，金聪聪（温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325000）



卵泡发育不均时优势卵泡排出后继续黄体期促排的可行性

金武敏，赵军招，王佩玉，余蓉，金聪聪
（温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325000）

[摘 要]目的：探讨不孕患者在体外受精常规促排卵过程中卵泡发育不均时，予优势卵泡排出后继续黄体期促排卵的可行性。方法：回顾性分析2012年5月至2014年2月期间温州医科大学附属第一医院生殖医学中心35例不孕患者，在体外受精常规促排卵方案过程中，B超监测卵泡发育不均出现优势卵泡后，至少有一个卵泡排卵后且测定血中孕酮升高大于8 nmol/L，继续予促性腺激素促排卵直至卵泡成熟，分析其获卵数及优质胚胎数等，本周期进行全胚冷冻，于下一周期根据患者排卵情况采用自然周期或替代周期进行内膜准备，然后进行冻融胚胎移植（FET），分析其种植率、流产率和临床妊娠率。结果：35例患者中除1例患者未获卵，34例总获卵数为412个，平均获卵数为（12.12±11.09）个。受精率为75.40%，卵裂率为71.12%，共获得优质胚胎数167个，冷冻胚胎数为158个，除外1例因胚胎解冻质量差而放弃移植，共完成第一次FET 为33个周期，继续第二次FET 3个周期，移植冻融胚胎数共74个，平均移植胚胎数（2.06±0.67）个，种植率为37.83%，hCG阳性率为63.89%。19例临床妊娠，累计临床妊娠率为52.78%。有1例患者孕2个月时流产，流产率为5.26%，已分娩10例，产下13个健康活婴，活产率为30.30%，余8例继续妊娠中。结论：体外受精常规促排过程中卵泡发育不均时，予优势卵泡排出后继续黄体期促排卵可获得理想的获卵数和优质胚胎数，而且后续冻融胚胎移植周期的累计临床妊娠率高，是一种安全可行值得期待的挽救方案。

[关键词]冻融胚胎移植；卵泡发育不均；黄体期促排

自1978年世界上第1例试管婴儿诞生以来，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术已经得到广泛应用。IVF-ET的主要步骤在于在控制性超促排卵（con-trolled ovarian hyperstimulation，COH）过程中，使用外源性激素，增大促卵泡激素（FSH）的募集窗，使得同一周期中多个卵泡同步发育，获得多个成熟的卵母细胞，增加移植优质胚胎的机会，从而提高临床妊娠率。虽然有降调节和高剂量促性腺激素（Gn）的使用，但在部分COH中仍有卵泡发育不同步的问题，即主导卵泡与次级卵泡直径相差大于4 mm以上。对于此类患者，往往由于新鲜周期被迫取消，给患者带来了极大的心理影响及经济损失。而作为一种新型的促排卵方案—黄体期促排，因其促排卵用药简单，而且不受月经周期的影响，正越来越受到广大研究学者的关注。本研究就不孕患者在体外受精常规促排卵过程中卵泡发育不均时，予优势卵泡排出后继续黄体期促排卵的可行性进行分析。

1　资料和方法

1.1一般资料 回顾性分析于2012年5月至2014 年2月间在我院应用体外受精常规促排卵方案过程中，B超监测卵泡发育不均出现优势卵泡与次级卵泡直径相差大于4 mm以上，至少有一个卵泡排卵后且测定血中孕酮升高大于8 nmol/L的35例不孕患者的资料，年龄23～38岁，平均（31.57±4.52）岁；不孕年限为1～13年，平均（4.12±2.48）年；体质量指数（body mass index，BMI）平均为（21.6± 3.19）kg/m2。原发性不孕患者比例为25%，继发性不孕患者比例为75%，平均窦卵泡数为（15.03±9.49）个。输卵管因素28例，原方案为黄体期长方案；多囊卵巢综合征2例，原方案为微刺激；卵巢储备功能下降5例，原方案为短方案。拟行黄体期促排前＜12 mm的平均卵泡数为（13.54±10.51）个，＜14 mm的平均卵泡数为（14.31±10.76）个。

1.2方法

1.2.1治疗过程：所有35例患者均在我院行常规促排卵方案，在促排过程中第8～第10天予B超监测发现主导卵泡与次主导卵泡的直径相差＞4 mm以上，B超提示至少有一个卵泡排卵后且测定血中孕酮升高大于8 nmol/L[1]者，经与其进行知情谈话同意继续治疗的，继续予黄体期促排卵和B超监测卵泡发育，测定血清黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮水平，根据卵泡发育情况和血清激素水平调整用药剂量。当卵泡平均直径至少有3个≥16 mm或者2个≥17 mm或者1个主导卵泡直径≥18 mm时，给予hCG 5 000～10 000 IU，34～36 h后经阴道超声引导下的穿刺取卵[（澳大利亚COOK公司提供的17G穿刺针和全自动负压吸引泵，负压100～120 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）]，根据患者丈夫精液情况给予常规IVF或卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗，受精卵经体外培养3～5 d后进行全胚胎冻存，包括早胚和囊胚。

1.2.2冻融胚胎移植（frozenembryo transfer，FET）前的内膜准备：自然周期：对于月经规律、有排卵的患者，当优势卵泡大于14 mm以上时，予以监测血清LH、E2、孕酮水平，当LH＞20 IU/L，即在当天下午14时予以注射hCG 10 000 IU进行黄体期转化；当LH≤20 IU/L，则在当天晚上21时予以注射hCG 10 000 IU进行黄体期转化，转化当天的内膜厚度至少达到8 mm，注射hCG后第2～第3天开始口服地屈孕酮片（商品名：达芙通，荷兰雅培制药有限公司产品）20 mg，每天2次，3～5 d后再根据胚胎情况进行选择解冻早胚或囊胚移植。激素替代周期：对于月经不规律、排卵障碍，或自然周期子宫内膜或卵泡发育欠佳者，自月经第2～第5天起口服戊酸雌二醇（商品名：补佳乐，德国先灵制药有限公司产品）每天4～8 mg，11～15 d后行超声检查子宫内膜厚度达8 mm时，每天口服雌激素及肌肉注射黄体酮针60 mg，3～5 d后再根据胚胎情况进行选择解冻早胚或囊胚移植。

1.2.3妊娠的确定：FET后，早胚移植于13 d后，囊胚移植于11 d后测血hCG，血hCG≥10 U/L为阳性。移植后4周行阴道超声检查，若观察到宫内孕囊，并见心管搏动者诊断为临床妊娠。若hCG下降，B超未见孕囊，则诊断为生化妊娠。

1.2.4黄体支持：患者自移植开始后继续每天给予肌肉注射黄体酮60 mg以及口服地屈孕酮片10 mg，每天2次。2周后复查血hCG，若阳性则予原剂量维持至FET后4周，4周时若超声提示临床妊娠，则继续每天口服戊酸雌二醇片6～8 mg联合黄体酮肌内注射40～60 mg，并口服地屈孕酮片10 mg，每天2次，用药至孕70 d，若有阴道出血，适当延迟停药时间直到出血停止。

1.2.5观察指标：观察黄体期促排患者的Gn使用剂量及天数、获卵数、优胚数、临床妊娠率、累积妊娠率、分娩活婴数等。优质胚胎的确定根据本中心实验室标准，即受精第2天3细胞以上胚胎、或受精第3天6细胞以上胚胎形态比较均匀且碎片＜20%。

1.3统计学处理方法 采用SPSS17.0统计软件。观察指标数据用±s表示。

2　结果

拟行黄体期促排后，Gn使用剂量为（1 286.43± 771.28）IU，Gn平均使用天数为（5.14±2.39）d。除1例患者未获卵，34例总获卵数为412个，获卵平均数为（12.12±11.09）个，受精数平均为（8.06± 7.91）个，共获得优质胚胎数167个，冷冻胚胎数为158个，受精率为68.45%。此外，无一例患者发生卵巢过度刺激综合征（ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS）。共完成FET周期数为33个，其中包括第一次FET周期30个，第二次FET周期3个，早胚周期数23例（占63.89%），囊胚周期数13例（占36.11%），移植冻融胚胎数共74个，其中50个移植早胚，占67.57%，24个移植囊胚，占32.43%，平均移植胚胎数（2.06±0.67）个。种植率为37.83%，hCG阳性率为63.89%，共19例获临床妊娠，累积临床妊娠率为52.78%。有1例患者孕2个月时流产，流产率为5.26%。已分娩10例，产下13个健康活婴，活产率为30.30%，余8例继续妊娠中。

3　讨论

3.1体外受精促排卵过程卵泡发育不同步的原因及处理 尽管COH中使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）和高剂量外源性Gn促使多个卵泡同步发育，但是各个卵泡FSH阈值不同，对Gn反应也不同。促排过程中，在基础内分泌水平相同的情况下，使用相同剂量的外源性Gn，卵泡簇中各卵泡发育速度呈阶梯式，推测与自然周期优势卵泡的选择机制一样，COH也可能存在卵巢内局部调节机制。有研究表明COH中卵泡液成分呈动态变化，因为不同卵泡细胞对外源性Gn的反应不同，分泌不同的激素、生长因子和细胞活素，各卵泡内的微环境并不一致，这些可能对卵母细胞活力和发育潜能有直接或间接的影响[2]。故COH过程仍可能出现卵泡发育不均的情况，而优势卵泡通过分泌局部生长因子及卵泡间的相互作用对毗邻卵泡的生长发育产生抑制[3]。对于卵泡发育不同步，在没有更好的处理方法的情况下，国内大部分中心的常规处理方法为大卵泡穿刺或是放弃本周期。

3.2孕酮对卵子发育的影响 众所周知，孕酮在人类生殖中占有重要的地位，可作用于卵巢及子宫，在卵细胞的发育成熟、排卵、胚胎发育、胚胎着床及维持妊娠等方面具有重要作用。在卵母细胞成熟过程中，促性腺激素首先作用于卵泡细胞产生孕酮，孕酮再作用于卵母细胞，并参与促成熟因子的激活，从而促进卵母细胞的成熟[4]。Aparicio等[5]研究表明，在牛卵母细胞培养液中加入3β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂，可明显降低囊胚形成速度，但这种作用在加入孕酮或孕酮激动剂后被完全阻断。也有研究发现在老鼠卵母细胞培养液中加入孕酮可以增加受精率及卵裂率[6]。在对恒河猴的研究中表明卵泡晚期的孕酮对卵子成熟与受精是必需的[7]。这些都说明孕酮在卵细胞质量方面扮演着重要的角色，与本研究中高孕酮环境下仍有较高的优胚数及受精率相符合。在排卵前卵泡里面的孕酮含量开始增加，同时伴随卵细胞减数分裂的恢复及成熟，可以推测孕酮在这个过程中可能起到了一定的作用。孕酮对卵细胞发育的影响是通过其受体介导的，其受体是一种核蛋白，在卵巢中呈高度表达，特别是在排卵前的颗粒细胞中。Sriraman等[8]研究发现孕激素受体是基因转录的一种重要的调控因子，特别是那些作用于成功排卵所必需的基因。在研究排卵前的颗粒细胞时，发现孕酮可能作为一种促存活因子及LH抗卵泡闭锁的一种中间递质，它的抗卵丘细胞凋亡的能力可能是由排卵前的颗粒细胞的孕激素受体介导的[9]。而卵丘细胞的低凋亡率可以引发卵细胞发育能力，这样能够促进卵丘细胞合成更多的孕酮，因此推测孕酮可能与抑制卵丘细胞的凋亡有关，但是它的具体原理并不清楚，可能是它在卵丘细胞成熟的一些关键途径及过程中起到了调节作用。但到目前为止关于孕酮对人类卵细胞的成熟及其质量的影响作用尚不能完全确定，有待更完整的研究。

3.3黄体期促排的可行性 本研究中患者出现优势卵泡的时候＜12 mm的卵泡数较多，若直接注射hCG则可能获卵数较少，使得可利用的胚胎较少，综合考虑经济效应及临床结局，结合国内大部分中心的处理方法，本中心的常规处理是取消周期，这不仅浪费了患者前期使用促排卵药物造成的经济损失，还给患者的身心带来一定的创伤；或者是进行大卵泡穿刺，国内学者[10]认为穿刺抽吸治疗与未穿刺进行对比未增加获卵率及妊娠率，且穿刺过程增加了患者的精神痛苦和经济成本，因此并非最佳治疗。黄体期促排卵是最近新兴的一种促排卵方式，其最开始用于为在化疗前紧急促排取卵癌症患者[11]，近几年来国内外学者[12-13]也证实了黄体期获取的卵子可以获得成熟并能成功受精，且比卵泡期获得的卵泡成熟率有升高趋势这是一种新的尝试，其优点是缩短疗程：一个月经周期内可以取两次卵，缩短患者等待时间，且促排用药简单、费用低；缺点是新鲜周期由于子宫内膜不同步不能移植，取卵后胚胎需冷冻。本研究体外受精常规促排方案过程中，B超监测至少有一个卵泡排卵后且测定血中孕酮升高大于8 nmol/L，虽然不属于真正意义上的黄体期促排，但其机制与其相符，均是在高孕酮状态下继续使用促性腺激素促排卵直至卵泡成熟。传统观念认为窦卵泡募集是从前个周期的黄体晚期开始，在卵泡早期或中期优势卵泡形成后其余卵泡闭锁。但是，最近研究显示在黄体期观察到的小卵泡不是一定趋于闭锁，更像是处于发育早期的卵泡[14]，因此继续予以促排卵药物可使卵泡继续发育。Kucuk等[15]研究认为黄体期促排有潜在的翘尾效应，其高孕酮和高E2可以抑制FSH和LH，在继续予外源性Gn后可以募集到更多卵泡，获得的成熟卵子增加，因此可利用的胚胎也相应增加。本研究中改行黄体期促排前＜12 mm的平均卵泡数为（13.54±10.51）个，继续使用促排药物后平均获卵数为（12.12±11.09）个，也与上述理论相符，优质胚胎率也达到了40.53%，且累积临床妊娠率也达到了52.78%，不仅挽救了该周期，且获得了较好的结局，为患者带去了妊娠的希望。李敏等[16]在卵巢储备功能低下患者应用微刺激、自然周期、超促排周期未获卵情况下使用黄体期促排，成功获得成熟卵子并受精形成胚胎。本研究中仅有2例为卵巢储备功能低下患者（大部分为输卵管因素不孕），原本的促排方案为黄体期长方案、微刺激、短方案，在改行黄体期促排后基本成功获得了一定数量的卵泡，且成熟率与受精率均令人满意，但是否说明了黄体期促排适用于各种患者各种方案还有待更大样本量的研究予以证实。

参考文献：

[1]MAMAN E,MEIROW D,BRENGAUZ M,et al.Luteal phase oocyte retrieval and in vitro maturation is an optional procedure for urgent fertility preservation[J].Fertil Steril,2011,95(1):64-67.

[2]GILCHRIST R B,LANE M,THOMPSON J G.Oocyte-secreted factors:regulators of cumulus cell function and oocyte quality [J].Hum Reprod Update,2008,14(2):159-177.

[3]GONZALEZ-BULNES A,VEIGA-LOPEZ A.Evidence of intraovarian follicular dominance effects during controlled ovarian stimulation in a sheep model[J].Fertil Steril,2008,89(5):1507-1513.

[4]陈大元.受精生物学[M].北京:科学出版社,2000:55-57.

[5]APARICIO I M,GARCIA-HERREROS M,O’SHEA L C.Expression,regulation,and function of progesterone receptors in bovine cumulus oocyte complexes during in vitro maturation[J].Biol Reprod,2011,84(5):910-921.

[6]ZHANG X,ARMSTRONG D T.Effects of follicle-stimulating hormone and ovarian steroids during in vitro meiotic maturation on fertilization of rat oocytes[J].Gamete Res,1989,23(3):267-277.

[7]BORMAN S M,CHAFFIN C L,SCHWINOF K M,et al.Progesterone promotes oocyte maturation,but not ovulation,in nonhuman primate follicles without a gonadotropin surge [J].Biol Reprod,2004,71(1):366-373.

[8]SRIRAMAN V,SINHA M,RICHARDS J S.Progesterone receptor-induced gene expression in primary mouse granulosa cell cultures[J].Biol Reprod,2010,82(2):402-412.

[9]FRIBERG P A,LARSSON D G,BILLIG H.Transcriptional effects of progesterone receptor antagonist in rat granulosa cells[J].Mol Cell Endocrinol,2010,315(1-2):121-130.

[10]贾学玲,顾崇娟,石馨,等.大卵泡穿刺抽吸用于GnRH-a长方案卵泡发育不同步时对IVF-ET结局的影响[J].实用妇产科杂志,2013(2):125-128.

[11]DEMIRTAS E,ELIZUR S E,HOLZER H,et al.Immature oocyte retrieval in the luteal phase to preserve fertility in cancer patients[J].Reprod Biomed Online,2008,17(4):520-523.

[12]CHIAN R C,CHUNG J T,DOWNEY B R,et al.Maturational and developmental competence of immature oocytesretrieved from bovine ovaries at different phases of folliculogenesis[J].Reprod Biomed Online,2002,4(2):127-132.

[13]MAMAN E,MEIROW D,BRENGAUZ M,et al.Luteal phase oocyte retrieval and in vitro maturation is an optional procedure for urgent fertility preservation[J].Fertil Steril,2011,95(1):64-67.

[14]BEDOSCHI G M,DE ALBUQUERQUE F O,FERRIANI R A,et al.Ovarian stimulation during the luteal phase for fertility preservation of cancer patients:case reports and review of the literature[J].J Assist Reprod Genet,2010,27(8):491-494.

[15]KUCUK T,SOZEN E.Luteal start of exogenous FSH in poor responder women[J].J Assist Reprod Genet,2007,24(12):635-638.

[16]李敏,王蔼明,商微,等.黄体期促排卵取卵在卵巢低反应患者中的应用[J].生殖医学杂志,2013,22(8):612-614.

（本文编辑：胡苗苗）

·临 床 经 验·

The feasibility analysis of luteal-phase ovarian stimulation after the dominant follicle ovulated in unsyn-chronized multiple folliclar development patients

JIN Wumin,ZHAO Junzhao,WANG Peiyu,YU Rong,JIN Congcong.Reproductive Medicine Center,the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325000

Abstract:Objective:To explore the feasibility of luteal-phase ovarian stimulation after the dominant follicle ovulated in unsynchronized multiple folliclar development patients undergoing routine controlled ovarian hyperstimulation (COH).Methods:From May 2012 to February 2014,35 infertile patients undergoing in-vitro fertilization (IVF) in Reproductive Medicine Center,the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University were enrolled in the study.When there comes unsynchronized multiple folliclar development during the routine COH,continue using Gn until the follcle matured after the dominant follicle ovulated and serum progesterone exceeded 8 nmol/L.The highest quality embryos were extracted and cryopreserved for the next frozen embryo transfer (FET) cycles.Analyze the number of oocytes retrieved,implantation rate,clinical pregnancy rate,ongoing pregnancy rate.Results:all patients succeeded in producing oocytes except one,a total of 412 ocytes were retrieved,the average number of oocytes retrieved was 12.12±11.09,producing 167 highest quality embryos,fertilization rate was 75.40%,cleavage rate was71.12%.A total of 158 ocytes were cryopreserved for later transfer.One patient quitted cycles because of embryos’ thawing failure.A total of 34 women underwent a total of 36 FET cycles,including 33 patients who completee one FET,3 who fi nished two FETs,and a total of 74 embryos were transferred.In FETs,the implantation rate and cumulative pregnancy rate were 37.83%,52.78%,respectively.One woman was reported to have miscarried in the fi rst trimester (5.26%).Of the 19 pregnancies in the study,10 resulted in live births and 8 were ongoing.Delivery follow-up showed 3 twin births and 7 single births,no malformations were reported in the newborns.Conclusion:Luteal-phase ovarian stimulation is feasible forbook=69,ebook=73producing competent oocytes/embryos in women undergoing routine controlled ovarian hyperstimulation (COH) after the dominant follicle ovulated in unsynchronized multiple folliclar development,with optimal pregnancy outcomes in FET cycles.It’s a safety and exciting remedial measure.

Key words:frozen embryo transfer; unsynchronized multiple folliclar development; luteal-phase ovarian stimulation

通信作者：赵军招，主任医师，教授，硕士生导师，Email：z.Joyce08@163.com。

作者简介：金武敏（1990-），女，浙江温州人，住院医师，硕士。

收稿日期：2014-09-25

[中图分类号]R711．6

[文献标志码]B

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.016