人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性

王 怡 尹艳丽

（协和干细胞基因工程有限公司 天津 300384）

人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性

王 怡 尹艳丽

（协和干细胞基因工程有限公司 天津 300384）

目的：探讨人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化方案和生物学特性检验效果。方法：利用原代贴壁培养法和酶消化法对人脐带内间充质干细胞进行培养，采用瑞氏染色法观察培养后细胞的形态，并利用流式细胞分析法对培养3代之后的间充质干细胞特异性标志物进行检验，同时检验间充质干细胞的生物学特性。结果：利用原代贴壁培养法后7d可得到增殖的纤维状细胞；利用酶消化法则可以在培养后5d得到增殖的细胞。两种方法获得的细胞均生长良好，细胞形态呈梭状，生长方式为螺旋状、细胞核较大。免疫表型中CD29阳性率可达95.28%，而CD31和CD34的阳性率则分别得到2.51%和3.38%。结论：利用酶消化法可有效提升人脐带间充质干细胞体外生长速率，并且其生物学特性无明显改变。

间充质干细胞；分离培养方法；生物学特性

间充质干细胞主要分布于早期胚胎的中胚层当中，其具有较强的分化潜能，属于多功能分化干细胞，并且能够分化形成人体骨骼、肌肉、韧带以及脂肪组织等。本文即是对人脐带间充质干细胞分离培养优化方法和生物学特性进行研究，具体如下：

1 材料及方法

1.1 实验材料

本次研究所选择的主体材料是由我市妇产科医院提供的脐带样本，购置的胎牛血清、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶、标记物（CD29、CD31以及CD34）、分离液、培养液等，实验设备则主要包括高速低温离心机、酶标记仪、流式细胞仪等。

1.2 方法

1.2.1 人脐带间充质干细胞的分离培养

在无菌操作台内提取人脐带样本，并将样本放置在培养基上，利用含有青霉素、硫酸链霉素等的缓冲液对脐带样本进行冲洗，充分将脐带内的残留血液冲洗干净。将脐带内的动脉、静脉以及外膜进行剥离，然后剪碎脐带，要求碎块大小为1mm3[1]。采用原代贴壁培养法的直接将脐带碎块接种在培养瓶当中；采用酶消化法的脐带碎块需要先经过胶原酶和胰蛋白酶的消化处理后再接种，要求接种密度为每平方厘米1×106。然后将两组培养瓶均放在恒温培养箱内孵化，要求培养箱温度设定在37℃，二氧化碳浓度为5%，每周更换1次培养液，每天均对培养瓶内脐带组织的增殖情况进行观察和记录。

待培养2周后，单层贴壁的增殖细胞汇合率应接近80%，此时利用胰蛋白酶对两种培养方式的细胞均进行消化处理，开展1：2传代，并且在培养2周后进行第3代传代[2]。

1.2.2 流式细胞仪标记物检测

当人脐带间充质干细胞培养3代后，利用胰蛋白酶对第3代细胞进行消化处理，并将该细胞加入100ml的PBS当中，要求浓度为1×106/ 100ml，分别记录（加入）适量的CD29、CD31以及CD34抗体，采用避光染色的方式处理30min，最终将染色后的细胞加入到浓度为1%的多聚甲醛当中制成重悬液，利用流式细胞仪进行检测[3]。

2 结果

2.1 两种培养方法的结果

采用原代贴壁培养法后约7d时间能够看到纤维状细胞从脐带组织的边缘溢出，生长状态良好；利用酶消化法培养后约3～5d即可看到纤维状细胞从脐带组织的边缘溢出。在两种体外培养方法传代后，人脐带间充质干细胞的生长状态均良好，其细胞形状均呈梭状，生长方式为螺旋状，每个细胞内细胞核均清晰可见，当培养到第3待后两种培养方法得到的人脐带间充质干细胞均排列紧密，待传到第10代之后，两种培养方法得到的细胞在形态上已经没有明显的差异。

2.2 人脐带间充质干细胞生物免疫特性分析

经过流式细胞仪的分析显示，两种培养方法所获得的细胞免疫表型中CD29阳性率可达95.28%，而CD31和CD34的阳性率则分别得到2.51%和3.38%。

3 讨论

在人体脐带当中共包含有两条主动脉、一条静脉和外包膜组织，而这些结构对于人脐带间充质干细胞的培养具有一定的阻碍作用，采用人工方法进行分离后不能保证这些组织完全剔除，因此需要采取分离培养方法。常用的分离培养法主要包括原代贴壁培养法、酶消化法等，这两种方法在分离培养后均能够获得大量高表达的粘附分子，其中以CD29为主。其中原代贴壁培养法的操作比较简便，使用的试剂较少，但是相对的其分离培养时间较长，本次研究中获得大量成熟细胞的时间为7d。而酶消化法不仅能够有效促进间充质干细胞的均匀生长，而且还能够对脐带上的胶原组织进行去除，有效缩短了培养的时间[4]。本次实验当中验证，两种培养方法传代到第3代后细胞间没有明显的差异，说明两种体外培养方法均能够实现间充质干细胞的分离细胞。因此，在实际应用过程中可以根据实验室的条件、所需培养时间等进行选择，如实验条件有限，但不需要固定培养时间的可采用贴壁培养法，降低操作技术难度；如实验室条件允许，且需要快速传代培养的，就需要利用酶消化法，保证培养时间。

[1]孙国栋，李志忠，王晶，等.人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究[J].西安交通大学学报（医学版），2010，31（02）：143～147.

[2]庞荣清，何洁，李福兵，等.一种简单的人脐带间充质干细胞分类培养方法[J].中华细胞与干细胞杂志（电子版），2011，01（02）：30～33.

[3]何绍清，罗振宇，刘秋英，等.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（14）：2492～2496.

[4]马锡慧，冯凯，石炳毅.人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展[J].中国组织工程研究，2011，15（32）：6064～6067.

R329

A

1004-7344（2016）03-0299-01

2016-1-6

王怡（1985-），男，天津河东人，助理工程师，本科，研究方向为干细胞。