药物介导的自噬改变对肿瘤细胞放射敏感性的影响

徐召南，王舒煜，毕也，胡月，周丽佳，张泽兵

(吉林大学口腔医院病理科，吉林长春130021)

药物介导的自噬改变对肿瘤细胞放射敏感性的影响

徐召南，王舒煜，毕也，胡月，周丽佳，张泽兵

(吉林大学口腔医院病理科，吉林长春130021)

放射治疗诱导的自噬与导致细胞死亡的凋亡起到的作用不同，其具有既可以导致细胞死亡又可以保护细胞生存的双重性。自噬这一过程在放射治疗和辐射毒性中的抗肿瘤效应还不明确。一系列药物试验已经证实诱导或者抑制自噬，直接影响细胞毒性和放射治疗的效果，同时发生的目标性自噬和凋亡似乎进一步增强了放射治疗的抗肿瘤效应。本文就调节放射诱导的自噬在肿瘤细胞中作用的研究进展进行简要综述。

自噬；放射治疗；诱导；肿瘤细胞；研究；进展

放射治疗在众多人类恶性肿瘤治疗方法中有较高的治愈率。电离辐射诱导的不可逆DNA双链破坏可活化正常细胞或癌细胞内蛋白酶，进而导致细胞凋亡。辐射后，细胞G2/M节点控制减少，导致自发性成熟前染色体浓缩和有丝分裂破坏，该途径被认为是一种辐射诱导细胞死亡的主要途径。有丝分裂破坏是有丝分裂延迟的结果。在有丝分裂延迟的细胞中，M期染色质浓缩直接导致细胞凋亡或者经历异常分裂致使微核和非整倍体核形成导致细胞死亡。然而因为肿瘤细胞对放射治疗的抗性使某些肿瘤的治疗效果并不理想。由于放射诱导的自噬作用在多种肿瘤细胞中都起到了作用。所以，研究通过调节自噬水平影响肿瘤细胞的放射敏感性及放射毒性，得到了广泛的重视。以下我们将通过迄今为止有限的研究结果，说明放射诱导的自噬在肿瘤细胞中的作用，并展望这一研究领域在临床实践中的益处。

1 自噬

自噬也被称为Ⅱ型细胞程序性死亡，是消化和循环利用长寿命蛋白、成熟核糖体，甚至全部细胞器包括内质网高尔基体和线粒体的一种细胞内途径[1]。因此，自噬作用是一种用于持续更新细胞内蛋白质细胞器的细胞内作用，是维持细胞内稳定状态的必需品。自噬由最近发现的自噬相关基因家族调控，即ATG家族。它是一种维持内环境稳定的自我降解过程，同时在移除错误折叠或聚集的蛋白质，清除受损的细胞器，如线粒体、内质网和过氧化物酶，以及消除细胞内的病原体这些过程中，也起到了“管家”的作用。因此，自噬普遍被认为是一种生存机制。然而，调节它的功能同样可以导致非凋亡性细胞死亡。除了消除细胞内的聚集体和受损的细胞器，细胞的自噬作用还可以促进细胞的老化和表面抗原的表达，可以针对基因组的不稳定性提供保护，同时防止坏死[2]。

在哺乳动物细胞中有主要有三种自噬形式，即巨自噬(Macro-autophagy)、微自噬(Micro-autophagy)、分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy)。巨自噬以被称作自噬小体的双层膜泡结构作为媒介传送细胞质内的物质，自噬小体再与溶酶体融合形成自噬溶酶体。与之相比，微自噬则是溶酶体直接通过它自身膜的内陷摄取胞质内物质。在分子伴侣介导的自噬中，由可溶性胞质内蛋白组成的池特定的池被分子伴侣/分子伴侣复合物识别，传递至溶酶体中[3]。简单起见，本文重点在于巨自噬，以下将用术语“自噬”代替。

自噬的核心机制主要有三种官能团组成：(1)ATG9及其系统；(2)磷脂酞肌醇三磷酸激酶(PΙ3K)及其复合物；(3)泛素样蛋白质系统，它包括两个泛素样蛋白，ATG12和ATG8(哺乳动物同源MAP1LC3/LC3)[3]。

自噬由致癌基因和抑癌基因以及其他分子机制共同调节。多重致癌基因可以通过PΙ3K/AKT/mTOR途径和抗凋亡蛋白功能作用从而下调自噬功能，反之，用雷帕霉素类似物(西罗莫司、替西罗莫司、依维莫司)和bcl-2抑制剂激活这些分子机制可以诱导自噬[4]。同样，一些肿瘤抑制蛋白，如死亡相关蛋白激酶1 DAPK1、PTEN和BNΙP3L诱导自噬，而其丢失则降低细胞自噬水平[5]。此外，辐射可以通过由于错误折叠的蛋白质积累而导致的适应性内质网应激反应激活自噬。内质网应激反应是由错误折叠的蛋白质积累通过上调atg12增加了LC3的转化，并且刺激自噬反应。

2 自噬和肿瘤细胞

在对肿瘤细胞进行放射治疗和化学治疗时，不同于凋亡作用会导致细胞死亡，自噬起到促使细胞存活和导致细胞死亡的双重作用。自噬过程可能同时是细胞死亡或者生存趋势的指示[6]。在放射治疗中，放射生物学家们探究肿瘤细胞表型和自噬性反应在存细胞死亡或存活之间的转化是很有意义的。

2.1 自噬与前列腺癌细胞莱菔硫烷(Sulforaphane)，一种存在于几种食用十字花科蔬菜中的抗肿瘤成分，在人前列腺癌PC-3和LNCaP细胞株中可以诱导自噬[7]。研究中，自噬的诱导起到了对莱菔硫烷引发的细胞凋亡的抵御机制。加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)则显著增强了细胞死亡，说明，莱菔硫烷诱导的自噬作用在自噬体中隔绝线粒体，导致细胞色素c释放延迟并激活内在的caspase级联[7]。类似地，LNCaP细胞可以依靠自噬途径在雄激素缺乏的条件下生存[8]。另一方面，cysmethynil(一种新化合物可以抑制前列腺肿瘤生长)抑制mTOR信号，在PC3型前列腺癌细胞中优先提高了细胞自噬性死亡(非细胞凋亡)，并且在前列腺癌细胞异种移植的鼠模型中抑制了肿瘤的生长。

在LNCaP型前列腺癌细胞中电离辐射诱导发生自噬性细胞死亡。这一现象实际上取决于受照射细胞的基因表型。例如PTEN，一种抑制侵略性前列腺癌的抗癌基因，可能参与自噬性反应。5 Gy照射后在前列腺癌PTEN-/-PC3型细胞株中诱导自噬，而在PTEN+/+DU145中则没有。但在PC3和DU145癌细胞株中，不增加磷酸化AKT、磷酸化mTOR和磷酸化S6的水平。值得注意的现象是在两种细胞中mTOR途径都保持不变，但是放射后自噬过程只在PC3细胞系中发生。用RAD001抑制mTOR途径上调自噬，同时增强了PTEN-/-PC3和PTEN+/+DU145两种细胞对放射的敏感性。此外，通过siRNA干扰ATG5和beclin1基因下调自噬反应，导致PTEN-/-PC3以及PTEN+/+ DU145两种细胞放射敏感性下降。用致敏剂如小白菊内酯(parthenolide)提高前列腺癌细胞对放射毒性反应仅发生在PTEN存在的情况下。说明对放射敏感性的选择性存在与自噬过程相关。这也表明，调控自噬作用可能对前列腺癌细胞的放射增敏和抗放射性亚群有特殊的价值。

2.2 自噬与结肠癌细胞通过Schonewolf等[9]的研究可以证实在HT-29和HCT116结肠癌细胞中，辐射可以诱导自噬反应。TEM表明在HT-29细胞系中，用8 Gy剂量照射细胞，与没有经过照射的对照组相比，24 h后可以观察到自噬反应发生，并且在照射组中自噬体形成增多。自噬是一种进化上保守的自我消化过程，细胞内的蛋白质和胞质内物质可以循环利用支持细胞在压力条件下生存。而通过自噬抑制剂氯喹(CQ)则可以增强结肠癌细胞系的放射敏感性，氯喹可以通过改变溶酶体的PH值抑制自噬反应的终末阶段，使自噬失去功能作用无法处理蛋白[10]。在Schonewolf等[9]的实验中，LC-Ⅱ水平的增高可以确认氯喹在HT-29细胞系中有效的抑制了放射诱导的自噬反应，并且因此可以认为这些细胞的放射增敏作用可以归结为氯喹介导的自噬抑制。上述研究中，氯喹介导的放射增敏作用仅发生在HT-29(p53基因突变型)细胞系中，在HCT-116(p53基因野生型)细胞戏中并没有作用。当然这些细胞系不能单纯仅在p53基因基础上进行比较，他们在放射增敏上表现的不同还需要进一步研究[9]。

2.3 自噬与食管鳞状细胞癌细胞根据Chen等[11]的实验研究，抑制自噬反应有助于食管鳞状细胞癌的放射增敏作用。自噬反应可以经常在经受过放射治疗的癌细胞中出现，3-MA可以抑制三磷酸肌醇3-激酶(PΙ3K)，被广泛地作为自噬抑制剂应用[12]。在Chen等[11]的实验中，在经过照射的食管鳞状细胞癌TE-1细胞系中，用3-MA抑制自噬作用，并通过检测细胞生存力、细胞周期及凋亡等方法评价阻断自噬反应对癌细胞放射敏感性的影响，应用6 Gy剂量照射后的TE-1食管鳞状细胞癌细胞系中，产生大量自噬体以及beclin-1和LC3-Ⅱ基因表达明显上调。与单独照射组相比，联合应用3-MA与放射作用于TE-1细胞系，显著降低了细胞生存力以及自噬基因beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白水平。下调自噬水平增加了放射诱导的细胞凋亡作用以及G2/M期细胞的百分比。实验结果表明下调自噬作用可以用于增加食管鳞状细胞癌细胞对放射治疗的细胞毒性反应[11]。

Chen等[13]应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于人食管癌细胞系EC9706细胞，通过集落形成测定肿瘤细胞的放射敏感性，此外在肿瘤异种移植的裸鼠模型中，评价3-MA联合放疗的细胞毒性作用。实验结果证明，辐射可以诱导自噬体在肿瘤细胞中堆积，同时3-MA又可以有效的抑制自噬体的积累。自噬抑制剂联合放射治疗在体内体外实验中都显著增强了肿瘤细胞的放射敏感性。并且，抑制自噬同时也增强了凋亡作用减少肿瘤细胞增殖。放疗协同抑制自噬可以明显的减小肿瘤细胞的体积。

2.4 自噬与肺癌细胞放射诱导自噬反应在肺癌细胞系中已有报道，单纯照射抗辐射非小细胞肺癌A549并没有改变细胞存活情况，但是黄连素(Berberine)和放射联合治疗则可引起剂量依赖性(5～10 μmol/L)自噬性细胞死亡和细胞周期阻滞，而在A549细胞系中观察到的细胞凋亡则占很少的比例。此外，黄连素联合放射治疗增强放射敏感性的治疗应用可能性，在路易斯肺癌模型小鼠中已经得到了证实，实验证明黄连素联合放疗作用导致了自噬性细胞死亡并使肿瘤体积大幅度缩小，而单独使用放射治疗和黄连素只能延迟肿瘤生长。根据李勇等[14]的实验，联合应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)下调低氧环境中人肺癌A549细胞的自噬水平，证明A549细胞在低氧环境中细胞保护性自噬增加，抑制自噬可以正确A549细胞的放疗敏感性。Albert等[15]证明单纯放射治疗或者联合使用ABT-888，在H460肺癌细胞中诱导自噬性细胞死亡达到7.3倍，细胞凋亡达2.8倍。此外，应用ABT-888/照射联合治疗可以在H460肺癌移植瘤中抑制肿瘤生长。在H460肺癌细胞系中，利用siRNAs减弱Bak/Bax凋亡蛋白功能和RAD001抑制mTOR信号，可以诱导自噬和提高放疗敏感性[14]。然而仅对细胞进行照射(5 Gy)并没有改变自噬过程。Kim等[16]发现照射剂量为5 Gy时并没有增强自噬反应，而在Albert等[14]的实验中，用更低的剂量3 Gy照射，自噬过程则明显增强。因为两个实验中检测自噬的方法相同，可以认为放射治疗中放射剂量大小对自噬过程的强度具有不同效果，也可能是有组织特异性的。在肺癌H460细胞系中，Caspase-3抑制剂Z-DEVD和mTOR抑制剂RAD001联合应用，可以通过诱发自噬性死亡增强放射敏感性。然而敲除ATG5和beclin1基因，这两种重要的自噬相关基因则诱导肺癌细胞对放射治疗的抗性[16]。

根据Liu等[17]的研究，抑制miR-191表达的肺癌细胞可以通过调节细胞自噬建立辐射抗性细胞。因此，可以通过改变miR-191的表达调节自噬作用，针对治疗低放疗敏感性肺癌。在Liu等[17]的实验中，两种抗辐射非小细胞肺癌细胞系中自噬相关蛋白如Beclin-1和LC3-Ⅱ表达上调，表明自噬在耐放射细胞系中作用增强。在乳腺癌、肺癌细胞株中的实验结果完全一致，一致表明通过各种刺激因子上调自噬可以增强放射造成的细胞毒性，如果同时发生细胞凋亡途径被抑制则进一步提高放射敏感性。

3 讨论

在应对辐射对肿瘤细胞产生的外部压力时，自噬有着两个作用相反的主要功能。一个是细胞保护功能，抑制这种作用可以增加肿瘤细胞对治疗手段的敏感程度；而另一种是细胞毒性功能，它可以直接促进肿瘤细胞死亡[18]。自噬通过清除损伤的线粒体和异常蛋白聚集体产生活性氧在肿瘤起始和癌变的早期阶段的一个重要作用抗癌。而且，敲除自噬相关蛋白和基因会引起DNA损伤和促进癌症发生。然而，一旦这种功能被克服，肿瘤已经形成，肿瘤细胞将会利用自噬对抗放疗或者化疗产生的细胞杀伤作用，这种生存机制将会促进癌症进展[19]。放疗是一种控制肿瘤生长的重要治疗手段，但是肿瘤会建立起适应性反应，使之对治疗产生高度抵抗性，具有更强的侵袭性。因此如何提高肿瘤的放疗敏感性引起了国内外极大的关注。调节自噬可能是对抗放疗抵抗的新的治疗靶点。但是，缺乏临床前期的动物实验模型用于证明自噬确实具有此功能。在动物模型中抑制自噬相关信号通路证明下调自噬可以起到增强肿瘤放疗敏感性的作用对于此方法的临床实践有着至关重要的作用。然而，仍有一些问题需要解决，因此，探索一种方法用来区分自噬的两种功能可以成为当前实验研究的方向。

通过前人的不懈努力，我们已经可以确认自噬与人类很多疾病都有密切的关联。同时，很多药物虽然可以抑制肿瘤细胞中的自噬水平，但是也破坏了正常组织的动态平衡。这就是为何尽管很多相关研究已经完成，还是无法揭示自噬在肿瘤治疗中起到的真正作用。

4 总结

肿瘤细胞在应对治疗时出现的自噬反应并不总是细胞死亡的迹象，它也可能是一种对抗治疗的细胞保护作用。可以推测，自噬在细胞生存和死亡之间起到了平衡的作用，这种细胞特异性高度依赖于致癌基因的表型以及凋亡相关蛋白的表达。通过调节自噬水平，改变肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，为更加高效的治疗疾病提供了新的研究方向。甚至，在肿瘤治疗过程中，也可以通过检测自噬水平预测放疗和化疗的效果。

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Influence of change in drug-mediated autophagy level on the radiosensitivity of tumor cells.

XU Zhao-nan,WANG Shu-yu,BI Ye,HU Yue,ZHOU Li-jia,ZHANG Ze-bing.Department of Pathology,School of Stomatology,Jilin University, Changchun 130021,Jilin,CHINA

Experimental results demonstrate that radiation-induced autophagy,a major pathway,which is different from apoptosis that leads to cells death,may lead to either death or survival.The role of autophagy in the antitumor effect of radiotherapy and in radiation toxicity is still obscure.A series of research have proved that inducing and blocking autophagy directly interfers with cytotoxicity and effect of radiotherapy.Simultaneous autophagy and apoptosis during radiotherapy seems to enhance the therapeutic effect.This review summarizes the up-to-date findings on the functions of regulating autophagic response of cancer cells to radiotherapy.

Autophagy;Radiotherapy;Ιnduce;Cancer cells;Research;Progress

R730.231

A

1003—6350（2016）13—2165—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.034

2015-10-22)

吉林省科技发展计划(编号:20150101174JC)

张泽兵。E-mail：645007015@qq.com