Rho/ROCK通路抑制剂在青光眼中的研究进展

何理烨，梁亮

(三峡大学第一临床医学院眼科三峡大学眼科与视觉科学研究所，湖北宜昌443000)

Rho/ROCK通路抑制剂在青光眼中的研究进展

何理烨，梁亮

(三峡大学第一临床医学院眼科三峡大学眼科与视觉科学研究所，湖北宜昌443000)

Rho/ROCK通路在细胞骨架的调节方面起到重要作用。Rho/ROCK抑制剂可以通过调节小梁网中肌动蛋白细胞骨架、细胞外基质以及Schlemm's管内皮细胞功能，从而降低眼压。同时，抑制Rho/ROCK途径，可增加视乳头血流量、维持视网膜神经节细胞生存、促进轴突再生，甚至发现在抗青光眼滤过术后能抗瘢痕化。考虑到其眼压调节、抗瘢痕作用和视神经保护特性，Rho/ROCK信号通路是抗青光眼治疗的重要目标，在不久的将来它将用于青光眼的推荐治疗方案。

Rho/ROCK通路；肌动蛋白细胞骨架；青光眼；视神经保护

青光眼是一种以视网膜神经纤维层中视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡并导致视野缺损为特点的视神经疾病。青光眼已经成为了导致全球范围内不可逆性失明主要病因，统计数据表明到2010年，全球已超过6千万人受此疾病困扰，推测到2020年，这个数字会上升到近8千万人[1-2]。青光眼发病初期并没有特殊临床症状，所以在发达国家中确诊率不到50%，在发展中国家的比例更大。从对青光眼认知及治疗过程看，眼内压被认为是最主要以及可控的危险因素，前瞻性多中心研究认为无论药物或手术将眼压降低在一定范围内都可以减慢青光眼患者视力损害以及延缓病情发展[3]。导致青光眼RGCs凋亡的确切机制尚不明确，但可能与顺、逆行轴突运输阻塞导致的神经信号剥夺有关。如果眼压超过视神经的承受范围，视网膜神经节细胞凋亡同时将出现筛板区的RGCs轴突退化。同时，青光眼神经病变发生可能与视神经细胞外基质(ECM)重塑有关[4]。现如今的青光眼研究，不仅仅着重于降低眼压，还需要将重点放在保护以及使视神经再生上，Rho/ROCK途径的多重作用能满足这一点而备受关注。下面将Rho/ROCK信号通道以及在青光眼中的研究进展做一综述。

1 Rho/Rock通路

Rho是Rho家族中的小分子鸟苷三磷酸酶(GTPase)，属于Ras超家族。Rho有三中异构体类型：RhoA、RhoB和RhoC，ROCk是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是Rho GTP酶的主要效应器[5]。含高度保守的富含半胱氨酸/组氨酸区域，与RhoA、RhoB及RhoC结合。ROCK有两种异构体类型：ROCK1和ROCK2。ROCK1和ROCK2序列64%相同，结构域保守，具有类似的底物特异性[6]。Rho激酶蛋白在大多数组织中广泛表达；ROCK2在大脑中高表达，而ROCK1却在非神经组织中高表达，主要是在肝脏肺。Rho/Rho激酶通路在肌动蛋白纤维、粘附斑形成以及调节肌动蛋白细胞骨架、细胞粘附、运动以及平滑肌收缩、轴突的伸长、神经元结构和细胞浆移动等方面起到决定性作用。Rho/Rock通路是通过特定底物(肌球蛋白轻链)磷酸化参与了细胞各种功能。肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化导致肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用，增加或减少磷酸化水平可以诱导细胞的收缩和舒张并影响肌动蛋白纤维构成以及平滑肌收缩[7]。所以说Rho/Rho激酶通路掌控了肌动蛋白细胞骨架和细胞收缩过程。

2 Rho/ROCK通路与眼压

眼压的调节是复杂的自我调节过程，具有波动性，由房水分泌与排出平衡决定。房水由睫状体上皮细胞分泌，主要经过两个途径排出。其中大部分经过小梁网途径，少部分房水通过葡萄膜巩膜途径。从小梁网途径排出的房水，再经过Schlemm's管最终汇入巩膜上静脉。而葡萄膜巩膜途径流入睫状肌空隙和脉络膜上腔[8]。而睫状体分泌房水量是恒定的，因此认为小梁排出途径障碍所致眼内压升高是引起原发性开角型青光眼的主要因素[8]。

房水流出阻力主要来自于小梁通道内壁。虽然最高阻力部位还不明确，但最可能部位是在小梁网、小管旁组织和Schlemm's管的交汇处[9]。在房水外流时其阻力增加的机制有两种假说，分别是细胞外基质异常堆积假说以及收缩假说。细胞外基质堆积假说源于在动物眼前节灌注金属蛋白酶用以消化细胞外基质成分，观察到可逆性的增加房水流出。收缩假说是源于实验性的破坏小梁网肌动蛋白骨架后，影响小梁网收缩，观察到阻力降低。最近研究表明，原发性开角型青光眼患者的小梁网组织结构更僵硬[10]。两个假说可能同时存在，因为小梁网细胞为增加其收缩能力就需要合成更多的纤维基质。

体内、外研究发现Rho/ROCKs在房水流出通路细胞中的表达。免疫印迹分析，RhoA/ROCKs在小梁网细胞、Schlemm's管细胞、睫状肌中表达，Nakajima等[11]利用RT-PCR技术在小梁网和睫状肌中发现ROCK1和ROCK2，并发现小梁网中ROCK表达远超睫状肌。Goldhagen等[12]通过免疫组化同样发现小梁网细胞、小管旁组织、Schlemm's管都分布有RhoA、ROCK1和ROCK2，并观察发现Rho/ROCK通道表达高低在正常眼与青光眼之间无显著差异。那么Rho/ROCK通路的相关药物就可以在青光眼疾病中使用。

一般来说，Rho/ROCK通路的激活会导致房水外流减少，从而增加眼压，而抑制Rho/Rock通路可导致房水外流增加的，从而降低眼压。眼灌注ROCK抑制剂发现小梁组织分离，肌球蛋白轻链磷酸化水平降低，说明细胞形态和房水流出的变化是由肌动蛋白细胞骨架变化引起的。猪和小鼠组织中发现，房水外流增多时RhoAV14以及对应siRNA表达显著减少[13]。Y-27632可降低眼压30%，H-1152P和HA-1077分别降低7.2 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和5.3 mmHg[14]。猴眼中，0.05%Y-39983降眼压程度几乎等同于0.005%拉坦前列素的降压效果[15]。snj-1656、Y-39983的眼用溶剂成品，已被证明在健康成人志愿者中有明确的降眼压效果，是一种安全的外用药[16]。因此，ROCK抑制剂可能是下一代青光眼治疗的主力军。

3 Rho/ROCK通路其他作用

抑制Rho/ROCK通路，可以增加视乳头血流量、提高视网膜神经节细胞生存、促进轴突再生，甚至发现在抗青光眼滤过术后能抗瘢痕化。

3.1 视乳头血流量增加正常人视神经乳头(ONH)可表达RhoA、ROCK1和ROCK2。人工培养青光眼视神经头星形胶质细胞可上调Rho GTP酶和某些细胞外基质蛋白表达，RhoA在青光眼中表达显著增加，表明RhoA/ROCK通路可能是青光眼视神经损伤的病理生理途径[12]。

Rho/ROCK通路在血管平滑肌细胞中表达，并且ROCK抑制剂已被证实具有放松血管平滑肌的作用，通过促使血管扩张可提高眼和视网膜血流量，因此，认为它能起到神经保护作用。离体血管细胞实验表明，血管内皮素、血管紧张素Ⅱ及肌张力产生收缩效应都由ROCk通路介导，因此应用ROCK通道抑制剂可以消除内皮素和血管紧张素Ⅱ引起的收缩作用[17-18]。体外实验表明，选择性ROCK抑制剂(Y-27632和Y-39983)可引起兔睫状动脉舒张，并呈浓度依赖性。说明舒张关键在于降低胞内收缩蛋白对Ca2+的敏感性和(或)改变Rho激酶调节状态。动物研究也表明，局部应用ROCK抑制剂(Y-27632、Y-39983和法舒地尔)可增加家兔视乳头血流量[19-20]。Okamura等[21]发现全身应用法舒地尔大鼠视网膜小动脉血管有扩张作用。Sugiyama等[19]还发现无论全身或局部应用法舒地尔均可抑制视乳头血流障碍。低血流灌注量被认为是青光眼视觉损害的关键因素，ROCK抑制剂可以增加并维持视乳头血流量，这也表明Rho/ROCK信号可能是青光眼视神经病变治疗的新方向。

3.2 提高RGC存活率在大鼠视神经损伤模型中，球内注射C3(RhoA拮抗剂)，发现可增加轴突再生及视网膜神经节细胞存活数量[22]。ROCK抑制剂(法舒地尔)能降低N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)对大鼠视网膜的神经毒性[23]。大鼠青光眼模型中，腹腔注射Rho激酶抑制剂(法舒地尔)可防止神经元凋亡，提示异常活跃的Rho/Rho激酶信号通路在病理生理层面可能参与了青光眼形成[24]。Rho/ROCK信号失活也助于在视网膜缺血再灌注损伤中保护神经元细胞。视网膜缺血再灌注损伤主要损伤视网膜神经节细胞，并在再灌注时相致神经元大量死亡。其损伤主要是由白细胞通过血管内皮浸润到神经组织，而Rho/Rho激酶通路通过调节白细胞和内皮细胞间紧密连接的细胞骨架助于白细胞外渗。ROCK抑制剂可通过降低Bax/Bcl-2 mRNA、表达Caspase-3和一氧化氮类以及调节白细胞浸润从而减轻缺血再灌注中视网膜神经节细胞凋亡程度[25]。此外，Tura等[26]还认为，ROCK抑制剂能够保护视网膜神经节细胞可能在一定程度上与降低星形胶质细胞的反应性有关。

3.3 促轴突再生中枢神经系统损伤后轴突再生障碍的因为促进神经元存活和轴突再生的神经营养因子(NTF)缺乏。结合某些NTF同源受体后ROCK可以改变肌动蛋白结构使其塌陷。抑制ROCK可以接受相对更多的NTF，同时发现Rho/ROCK途径与抑制轴突的伸长信号相关，所以抑制该途径可以促进轴突再生。在兔体内及体外外伤性视神经损害中，应用法舒地尔明显降低了Rho/ROCK表达，明显缓解神经节细胞凋亡，轴突再生明显[27]。

3.4 抗瘢痕化在抗青光眼手术中，小梁切除术失败的主要原因是滤过泡术后瘢痕的形成。成纤维细胞在瘢痕形成过程中起关键作用，虽然手术中使用抗代谢药物如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素C(MMC)对限制瘢痕形成有一定效果，但这些药物会产生严重的副作用[28]。结膜滤过泡瘢痕主要是集中在Tenon囊处的成纤维细胞的增殖、迁移及收缩引起。青光眼滤过术后，由于破坏了血-房水屏障，Tenon囊处的成纤维细胞可能通过血浆与LPA接触，促进Rho/Rock通路激活表达α-SMA，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞增加胞外基质合成，肉芽组织促瘢痕形成[29-30]。ROCK抑制剂可以抑制细胞的迁移、侵袭和分化，因此Rho/ROCK通路在滤过泡愈合过程中可起到关键的调控作用。表明ROCK抑制剂通过抑制成纤维细胞分化而作为一种有效的抗瘢痕药物。在青光眼滤过手术后应用AMA0526，在不同程度的伤口愈合过程中，对Tenon囊成纤维细胞增殖以及肌成纤维细胞转化都有不同程度的影响及干扰作用。这些数据表明，ROCK抑制剂可能会被认为是更像一种生理性药剂，可以特别针对伤口愈合，以提高青光眼手术的滤过效果[30]。

4 Rho激酶抑制剂的临床试验

虽然全球正致力于开发各种蛋白激酶抑制剂去治疗青光眼等慢性疾病。在Rho激酶抑制剂中，到目前为止，只有盐酸法舒地尔(HA-1077)上市，主要用于脑血管保护方面[31]。在K-115Ⅰ期试验中50名健康志愿者分别在0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%逐步递增浓度及安慰剂治疗后，2次/d，连续用7 d。发现2 h后最高浓度下眼压可降低4.3 mmHg，但超半数志愿者有轻度结膜充血症状，但可在几小时内自行消退。Tanihara等[32-33]认为0.4%k-115是最适浓度。Ⅱ期试验中，210例原发性开角型青光眼或高眼压症患者接受0.4%的k-115治疗，2 h后平均眼压降低4.5 mmHg，并具有统计学意义。AMA0076仅在房水外作用，该药物可迅速转化为活性形式，可随后排出体外，可能减少充血的不良反应。临床试验几乎没有观察结膜充血，但平均眼压仅降低3.7 mmHg[34]。虽然在动物实验和Ⅰ期临床试验中有不错表现，但在Ⅱ期试验后被淘汰，其中的原因一般是严重副作用和持续降眼压效果不佳。所以并不是所有的ROCK抑制剂都可以治疗青光眼，我们要考虑其对人体的耐受性及副作用。

5 Rho激酶抑制剂治疗风险

在全身范围内，ROCK抑制剂可以降低血压和血管阻力，在用药时，不可避免相应副作用的出现。在青光眼治疗中，为了只针对局部起作用而避免全身副反应，药物如k-115仅在房水通道中保持活性，但在临床试验中，不可避免的引起扩张局部血管引起结膜充血[33-34]。但这是药物本身的部分药理作用，并不能完全去除，同时眼药中含有防腐剂成分，笔者认为不能忽视其对局部的刺激作用引起充血。同时要强调，虽然在临床试验没有出现结膜出血情况，但在动物研究中曾发生结膜出血的情况所以，并不能完全肯定说ROCK抑制剂是没有风险的。考虑到这种结膜充血会在几小时内自然消退，那么今后可在睡前用药以减轻对生活的影响。因为ROCK属于一类丝氨酸/苏氨酸激酶，高浓度抑制剂可能会影响包括蛋白激酶A、蛋白激酶C等在内的其他蛋白激酶在体内的作用。Arnold等[35]研究发现ROCK抑制剂可抑制β受体阻断剂(马来酸噻吗洛尔)对眼内渗透作用而降低其降压效果。这可能与扩张结膜血管后清除作用增强有关。因此，在对青光眼治疗中，选用ROCK抑制剂时，需了解其作用机理，选择合适的治疗方案，警惕是否将ROCK抑制剂与其他降眼压药物同时使用，应该制定新的药物治疗方案，减少拮抗作用，提高治疗效果。

6 展望

ROCK抑制剂不仅仅具有降眼压作用，还能在抗青光眼滤过术后抗瘢痕形成，最重要的是还参与了视神经保护，能改善眼血流量、提高视网膜神经节细胞存活和促轴突再生。这几个方面足以引起我们重视，将其作为一类新的药物来减缓青光眼发展进程。在今天，青光眼药物种类繁多，一般通过抑制房水生成而降低眼压，而ROCK抑制剂是通过介导调节肌动蛋白调节房水流出，从而最终降低眼压。在过去的十年中，因疗效不足或严重结膜充血等不良反相当多的ROCK抑制剂在临床试验中失败。尽管如此，ROCK抑制剂仍在不断试验更新，在不久的将来可能可以进入青光眼治疗指南，这是对青光眼治疗的重大进展。

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Research progress of Rho/ROCK pathway inhibitors in glaucoma.

HE LI-ye,LIANG Liang.Department of Ophthalmology,the First Clinical Medical College of China Three Gorges University;Institute of Vision and Ophthalmology, China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA

The Rho/ROCK pathway plays an important role in the regulation of cytoskeleton.Rho/ROCK inhibitor reduces the intraocular pressure(ΙOP)through modulate of the actin cytoskeleton in trabecular meshwork and adjusts the function of extracellular material and Schlemm's vascular endothelial cells.At the same time,the inhibition of Rho/ROCK can increase the flow of the optic nerve head,maintain the survival of retinal ganglion cells,promote the regeneration of axons and even can be found the function of anti-scarring after glaucoma filtration surgery.Taking into account the effect of the regulation of intraocular pressure,anti scarring and the protection of the optic nerve,Rho/ROCK signaling pathway is an important target for the treatment of glaucoma.Ιt will be used for the treatment of glaucoma in the near future.

Rho/ROCK pathway;Actin cytoskeleton;Glaucoma;Optic nerve neuroprotection

R775.2

A

1003—6350（2016）13—2161—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.033

2015-11-22)

湖北省自然科学基金(编号：2013CKB027)

梁亮。E-mail：liangliang419519@163.com