浅谈影响种公牛冻精生产的若干技术因素

韩　星

(辽宁省畜牧业经济管理站，辽宁 沈阳 110032)



浅谈影响种公牛冻精生产的若干技术因素

韩星

(辽宁省畜牧业经济管理站，辽宁 沈阳 110032)

摘要：通过对冻精生产中，能够影响精子生命的几个环节(采精、精夜稀释、冷冻技术、解冻方法等)存在的问题及影响因素进行分析研究，提出了提高精液质量的建议。

关键词：种公牛；冻精；质量

随着应用冷冻精液进行人工输精技术的推广普及，对冷冻精液的数量需求逐渐扩大，同时对冻精产品质量的要求也提高了。然而在冻精生产过程中对精子造成伤害的因素有很多。因此，在制作冻精时，一定要设法使破坏精子生命力的因素减少到最低程度以致消除。通过对冻精制作中几个环节的分析，以寻求有利于精子生命的最佳制作条件。

1采精技术及精液品质检查的影响

1.1采精技术的影响

采精是冻精生产的第一个环节，采精技术的好坏直接影响到精液的质量。在采精过程中，技术是否熟练及假阴道的压力、温度、润滑度是否适宜，对精液是否成功采集十分重要。采精所用的种公牛必须保证体质健壮，无肺疫、结核病、布氏杆菌病等传染病。对于成年种公牛每周采精两次，每次可根据具体情况和需要连续采精两回。采精过频会导致精液量少，密度低。长时间不采，会导致所采精液中死精过多，两者都不利于冻精生产和种公牛生产潜力的发挥。

为保证所采精液不受污染，采精场地应事先打扫干净，并做好消毒工作。采精前公牛的后躯，特别是尾根肛门等部位先用温水彻底清洗干净，再用干净抹布擦干。种公牛的阴茎和包皮先用温水洗净，然后用灭菌生理盐水冲洗干净。此外，采精前种公牛还需要一个性准备的过程。实践证明，公牛采精前性准备充分与否直接影响到采精量、精子的活率和密度。因此在采精前常用一些诱情方法，如是公牛在母牛附近停留片刻进行多次空爬跨或让待采精的公牛观摩另一头公牛爬跨等。这些准备活动有助于精液质量的提高。

1.2精液品质的影响

精液采下后要对其品质进行检查。首先是肉眼观察，正常精液一般为乳白色或淡黄色。如精液带绿色，则精液中有脓液或尿液；若带红色或红褐色，可判断该牛有炎症。这时精液应该废弃不能进行冷冻。对于肉眼检查合格的精液，还要进一步通过显微检查，查看精子密度、活率、畸形率、顶体完整率的情况，对于低于规定标准的精液要废弃。经检查各项指标合格者，才能进一步稀释、冷冻。只有精液原液的质量好，才能保证冻精的质量。为防止低温对冻精的冷打击，检查过程需把精液放在30 ℃的水浴中，以免影响精子的活力。

日光灯对精子有不良影响，日光照射也如此，因此在进行精液检查时应尽量减少不必要的光照。同时，还要避免对精子有害射线的辐射。

2稀释液的配制及甘油含量的影响

2.1稀释液保护剂对冷冻前精子活力的影响

稀释液保护剂的好坏对冷冻前精子的活力有很大的影响。配制稀释液所用的药品试剂必须是分析纯的，蒸馏水用重蒸馏的，要求纯净、新鲜。药品试剂按一定比例混合，溶解过滤，还要密封消毒处理，以确保对精子无害或危害甚微。消毒采用煮沸的方法，煮沸时间不宜过长，以防止炭化变质，起不到保护精子的作用。抑制细菌的青链霉素不是多多益善，一般按每100 mL稀释液加50～100万单位，用量过多对精子有杀害作用。

2.2 血细胞常规和骨髓细胞形态分析 骨髓中原始细胞比例，外周血中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)的量在CD56+和CD56-组间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2甘油对精子活力的影响

稀释液既是精液的营养成分，又是保护剂，甘油是其中的冷冻保护剂之一。甘油的保护作用是通过减缓水的结晶过程，缩小危险温区的范围来实现的。但并非是加入保护剂后，危险温区就不存在了，牛精子的危险温区是0～-60 ℃，其中最危险的温区是-15 ℃～-25 ℃。通过稀释液中加入甘油后，能冲淡溶液的浓度，也就是说甘油代替一部分游离水进入精子细胞内，使游离水连同无机盐一起被排除，降低细胞内溶质的浓度，阻止在-15 ℃以下引起精子蛋白质变性，在冷冻过程中起到一定的保护作用。此外，甘油还容易通过细胞膜，解冻时能保护精子免受稀释性伤害，还可使精子中的G07酶免受冻害而溢出。

实践证明，甘油在常温下对精子有害，可以损伤精子顶体和破坏某些酶。因此，稀释液中不可没有甘油，但又要减少其含量。据各种资料报道牛精液稀释液保护剂中甘油含量减少到5%～7%效果较好。甘油含量减少到3.3%左右时效果会更好。但是目前采用的一次稀释法无法控制甘油的最终浓度：比如10%的甘油稀释液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例稀释，其最终甘油浓度分别为5.00%、6.60%、7.50%和8.00%。可以看出，稀释比例越小最终甘油含量越少。而且经测定，一次稀释法G07酶漏到精子里，说明精子膜已受到伤害。

为了解决这两个问题，人们在实践中摸索出两次稀释的方法：第一次先加入无甘油的稀释液，加到所需稀释总量的一半，第二次(含甘油10%的稀释液)加到所需总量，这样一来，无论稀释倍数多大，甘油浓度都是5%。但要注意，第二次需在降温后缓慢加入，因为刚采到的活跃精子在高渗环境中受打击很大。

3稀释液温度变化的影响

温度影响精子的代谢率和活力，精子在体温(37 ℃～38 ℃)情况下保持正常运动，如果高于这个温度，则活动加剧。据有关实验表明，精子能忍受的最高温度约为41 ℃。精子在低温环境下，代谢活动受到抑制。但是，使精液温度缓慢降至0 ℃，对精子的存活力没有影响，而温度下降急剧，则会对精子的代谢、活动力、受精性能造成不可逆的不良影响。这是因为精子的细胞膜受到破坏，从而使三磷酸腺苷、红细胞素、蛋白质等从细胞膜破坏处漏出。精子的渗透压增加，产生不可逆的变化，以致损害其结构和活动力，这就是所谓的低温打击。鉴于此，在稀释精液时一定要把稀释液放在30 ℃左右的恒温箱中，使所采新鲜精液和稀释液处于同一温度的水中。特别是在寒冷的冬季，自然状态下的稀释液会下降到0 ℃左右，而新采的精液却比体温略低，这样30 ℃的鲜精液猛然和0 ℃左右的稀释液相遇，会对精子造成不可逆的损伤，使相当一部分精子失去活力。稀释液必须经过预热和新鲜精液处于同一温度水平下进行稀释。对于稀释后的精液，应放入低温操作装置中，使精液温度缓慢降至0～5 ℃。

4冷冻技术因素的影响

精液冷冻是精液处理过程中相当关键的一个环节，冷冻技术的好坏对冻后精子活率的影响很大。如果此环节把握不好，即使前面的工作做的再好，也会前功尽弃。在精液冷冻技术中，由冷冻温度和降温速度构成的冷冻温度曲线是影响精子冷冻后活率、顶体完整率等的主要因素。冷冻过程中精子通过对细胞产生致死性伤害的危险温区(0～60 ℃)速度，决定着冷冻后精子活率的高低。

4.1冷冻精液生产中的温度变化

冷冻精液时，精液和冷冻环境之间有着120～180 ℃的温差，因此二者之间存在着热交换的过程，直到温差为零，即达到所谓的热平衡状态，维持片刻后精液与冷冻面的温度变化同步下降，达到要求的温度后浸入液氮。精液降温要求快速通过0～60 ℃的危险温区，以保证冷冻精液的质量。精液降温的速度与冷冻容器、冷冻环境的温度及每批精液冷冻总容量有着直接的关系。北京和洛阳种公牛站的测试结果表明，随着每批冷冻精液量的增加，热平衡温度升高，降温速度减慢，通过危险区的时间延长。增大冷冻容器的热容量，减少精液部分的热容量，特别应注意承载精液的钢架式冷冻板面必须经预冷至始冻温度，以加速精液的降温速度，使精液尽快通过危险温区。

4.2.1细管型

冷冻前冷冻槽中要倒入适量的液氮，盖上槽盖，使之有个预冷的过程。细管及管内精液温度冻前要求与承载细管的网架保持一致。往网架内装细管精液时在4～5 ℃的低温箱内进行操作，同时筐内各网孔要尽量装满，以保证冷冻过程保持一定的降温曲线。冻制细管精液并不是直接把金属网架浸入冷冻槽中进行冷冻，这样会造成大批精子死亡。冷冻时，金属网架在液氮面上停留一会儿，保证始冻温度在-8 ℃～-1.2 ℃范围内。北京种公牛站的测试结果表明，始冷冻在此范围内冷冻效果较好。目前承载细管精液用的是冷冻筛板或金属网架，一次可冷冻细管数百支。

4.2.2颗粒型

颗粒精液用铝板、铜网或聚四氟乙烯板等材料作为冷冻面，精液是陆续逐粒滴在冷冻面上。因此造成精液颗粒之间始冻温度存在差异，随着滴冻精液数量的增加冷冻面的温度升高，始冻温度也不断升高。如果冷冻面质量或导热性能差，加之外界气温环境的影响，精液降温速度缓慢，通过危险区的时间延长，很容易使精液进入危险温区，造成冷冻效果不好。为了保证冷冻精液的效果，目前国内使用聚四氟乙烯板冻制颗粒精液，充分利用它隔热性能好这一特点，减少颗粒精液之间的始冻温度差异。同时，在滴冻前要使精液和接触精液的器皿如滴管、小试管等，保持同一温度0～5 ℃。精液在滴冻前要混合均匀，使滴冻出的颗粒精子密度均匀。在滴冻过程中要迅速滴冻，滴冻结束后容器需加盖，以减少在外界气温下的暴露时间，确保冷冻效果。

5解冻温度与解冻方法的影响

精液解冻相对冷冻来说方法比较简单速度快，但不能说解冻不重要。牛精子的危险区域是0～-60 ℃，所以要以最快的速度越过这个区域，使精子不至于受到伤害，这是解冻中要解决的一个关键问题。目前世界各国所采用的解冻温度不尽相同，通常采用的温度有快速(40 ℃)，室温(15～20 ℃)和冷水(4～5 ℃)缓慢解冻三种。我国当前多采用35～40 ℃水浴快速解冻的方法。还有些试验结果表明，用75 ℃ 12 s，95 ℃ 7 s，98 ℃5 s瞬间解冻0.5 mL细管精液或用100～135 ℃ 5 s解冻0.25 mL细管精液，解冻后活率高，顶体完整率可达76%，明显高于35～40 ℃下解冻的精液，而75 ℃与90 ℃相比较无差异。尽管解冻温度越高，解冻速度越快，越过危险区的时间就越短，但是生产实践中还有一个经验的问题，精子处于高温下时间过长，容易使精子在短时间内的能量耗尽，而时间短了达不到解冻的目的。因此高温快速解冻多数只是在实验室中进行，在生产上还未得到普遍采用。

对于颗粒冻精的解冻，由于精液在冷冻前稀释倍数较低，解冻时需加解冻液，解冻液一般用0.9%的柠檬酸钠液，把1～1.5 mL的柠檬酸钠液滴入小试管中，然后把小试管放在40 ℃的温水中预热，将颗粒冻精从液氮中取出立即投入小试管中轻摇，待融化到2/3时，从温水中取出，继续摇动使其全部融化。

精液解冻后使用时间，细管为1 h(上限)，颗粒为2 h(上限)。如解冻后需外运时，可采取低温10～15 ℃解冻，然后用脱脂棉或多层纱布包裹，再用塑料袋包好，置4～5 ℃的环境中储存，其使用时间可达8 h。

实践证明，冷冻精液在室温中停留过久(超过10 s)精子的活力会降低。因此，在解冻前后取放精液时，动作尽量迅速、减少在空气中停留的时间，若停留时间过长中途要放回液氮中冷却一会儿再接着操作。

6讨论

在实践中掌握和运用熟练的采精技术，了解个体采精特点，正确掌握种公牛的采精频率，同时做好夏季防热避暑工作，为种公牛创造比较舒适的环境，是充分发挥其生产潜力，使其提供数量多、质量好冻精产品的重要措施。

稀释精液不能没有甘油，但又要越少越好，目前一般为5%～7%。但有资料证明3.3%的甘油含量效果最佳。在降低稀释液中甘油浓度的情况下，提高冻精质量而又不至于使程序复杂化，还有待于进一步研究。

当初冻温度为-110 ℃～-120 ℃，冷冻细管距液氢面高度4 cm，冷冻数量200～250支细管精液时，冻后活力可达0.45，经生产推广应用效果颇佳。但也存在一些问题，操作存在一定的误差，特别是初冻温度不易控制一致。要想解决这些问题，需要生产出更先进的冷冻设备。

制作冻精是工作的关键，但没有优质的解冻液和正确的解冻方法，效果同样不理想。试验中温度越高，解冻速度越快，但是这个温度很难把握，就会使还未进入子宫的精子能量消耗殆尽。所以实际生产中，解冻温度控制在40±2 ℃为宜。用维生素B12作颗粒冻精解冻液，解冻后精子活力提高，活力下降速度缓慢，人工授精受胎率明显提高，可进一步推广应用于生产中。

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作者简介：韩星(1971-)，男，大专，助理畜牧师。

收稿日期：2016-01-11

中图分类号：S823.3

文献标识码：B

文章编号：1005-2739(2016)02-0061-04