HPLC法检测脱氢环氧甲基醌霉素中间体N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺及其杂质Δ

胡克余，汪岩峰，余卫麟，马 俊，邓双炳（深圳万和制药有限公司，广东深圳 518057）

HPLC法检测脱氢环氧甲基醌霉素中间体N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺及其杂质Δ

胡克余＊，汪岩峰，余卫麟，马 俊，邓双炳#（深圳万和制药有限公司，广东深圳 518057）

目的：建立检测脱氢环氧甲基醌霉素（DHMEQ）中间体N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺（MA）及其杂质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Utimate AQ-C18，流动相为乙腈-0.05%磷酸（梯度洗脱），流速为1 ml/min，检测波长为230 nm，柱温为30Ⅱ，进样量为10 μl。结果：MA与各杂质间以及各杂质之间的分离度均＞1.5，理论板数以MA峰计≥5 000，保留时间约为41 min；MA、乙酰水杨酸甲酯、SM2、SM1、MA-6、水杨酸、MA-2的定量限（相当于MA样品的百分比）分别为0.04%、0.03%、0.01%、0.05%、0.05%、0.05%、0.05%，检测限（相当于MA样品的百分比）分别为0.01%、0.01%、0.004%、0.02%、0.02%、0.02%、0.02%；溶液稳定性及方法耐用性良好。结论：该方法专属性、检测限、耐用性均符合要求，可用于检测DHMEQ中间体MA及其杂质。

脱氢环氧甲基醌霉素；中间体；N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺；杂质；高效液相色谱法

脱氢环氧甲基醌霉素（Dehydroxy methyl epoxy quinomicin，DHMEQ）是由抗生素经结构改造合成的一种新型小分子核因子-κB（NF-κB）抑制剂，具有抗癌和抗炎活性[1]。DHMEQ可特异性抑制NF-κB移位入核，以1∶1的化学计量比共价修饰p65和其他Rel同源蛋白中的特定半胱氨酸残基[2]。DHMEQ作为NF-κB抑制剂，通过在各种疾病的动物模型中进行广泛测试，证明其对治疗实体瘤、血液恶性肿瘤、关节炎、肠缺血和动脉粥样硬化在内的疾病具有广谱效力[3]，因此DHMEQ有望在临床上用于癌症和炎症疾病的治疗。

N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-2，5-二甲氧基苯胺（简称MA）是DHMEQ合成过程中一个重要的中间体，它的纯度对终产品DHMEQ有显著影响，故很有必要对其纯度进行控制。结合合成工艺路线进行分析，MA中潜在的有机杂质分别是水杨酸、阿司匹林（简称SM1）、2，5-二甲氧基苯胺（简称SM2）、乙酰水杨酰氯[高效液相色谱法（HPLC）检测时溶剂含有甲醇，乙酰水杨酰氯以乙酰水杨酸甲酯形式存在]以及MA-2、MA-6两个工艺杂质。因此，本课题组采用HPLC法检测DHMEQ中间体MA及其杂质，旨在为该中间体的纯度控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695型HPLC仪，包括2998 PDA二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；MS105型十万之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

MA样品（自制，批号：20160523、20160607、20160706）；MA对照品（自制，批号：20160512105，氢谱、碳谱核定结构，HPLC测定纯度为99.6%）；乙酰水杨酸甲酯对照品（东京化成工业株式会社，批号：AG02，纯度：98.9%）；水杨酸对照品（批号：100106-201104，纯度：99.9%）、SM1对照品（批号：100113-201405，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院；SM2对照品[阿法埃莎（中国）化学有限公司，批号：10183987，纯度：98.6%]；MA-2对照品（自制，批号：20160104，氢谱、碳谱核定结构，HPLC法测定纯度为100%）；MA-6对照品（自制，批号：20160123，氢谱、碳谱核定结构，HPLC法测定纯度为99.0%）；乙腈为色谱纯（德国Fisher公司），磷酸为色谱纯（美国Tedia公司），其余试剂为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Utimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0 min，20.0%A；5 min，20.0%A；10 min，25.0%A；15 min，25.0%A；30 min，45.0%A；40 min，45.0%A；45 min，20.0%A；50 min，20.0%A）；流速：1 ml/min；检测波长：230 nm；柱温：30Ⅱ；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶剂 取冰乙酸10 ml，置于1 000 ml量瓶中，用甲醇定容，混匀，即得空白溶剂（即1%冰乙酸甲醇溶液）。

2.2.2 混合对照品溶液 取乙酰水杨酸甲酯、水杨酸、SM1、SM2、MA-2、MA-6对照品各约10 mg，精密称定，分别置于20 ml量瓶中，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，摇匀，制成各单一对照品贮备液；另取MA对照品10 mg，精密称定，置于20 ml量瓶中，加入各单一对照品贮备液0.2 ml，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，摇匀，制成含MA 0.5 mg/ml和乙酰水杨酸甲酯、水杨酸、SM1、SM2、MA-2、MA-6均约为1%的混合溶对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取MA样品约25 mg，精密称定，置于50 ml量瓶中，加1%冰乙酸甲醇溶液适量，振摇使溶解，用1%冰乙酸甲醇溶液定容，摇匀，即得。

2.3 系统适用性与专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂各适量，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度均＞1.5；理论板数以MA峰计≥5 000，保留时间约为41 min。

2.4 定量限与检测限考察

取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，分别按“2.1”项下色谱条件连续进样测定，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），结果见表1。由表1可知，当MA质量浓度为0.5 mg/ml时，MA及各杂质的检测灵敏度均符合ICH Q3A（新原料药中的杂质）指导原则关于报告限度的要求。

2.5 稳定性与耐用性考察

2.5.1 稳定性试验 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、10 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，MA及各杂质峰面积的RSD均＜10%（n＝5），表明混合对照品溶液室温下放置10 h内稳定性良好。2.5.2 耐用性考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，分别在不同波长、流速、柱温、流动相比例及不同批号色谱柱条件下，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，在不同波长[（230±1）nm]、不同流速[（1.0±0.1）ml/min]、不同柱温[（30± 5）Ⅱ]、不同流动相比例（±2%）、不同批号色谱柱条件下，MA及各杂质含量的RSD均＜10%，表明方法耐用性良好。

2.6 样品纯度测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算MA的纯度。结果，3批（批号：20160523、20160607、20160706）样品的纯度分别为96.5%、97.3%、95.0%（n＝3）。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.空白溶剂；1.SM2；2.SM1；3. MA-6；4.水杨酸；5.乙酰水杨酸甲酯；6.MA-2；7.MAFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample solution；C.blank control；1. SM2；2.SM1；3.MA-6；4.salicylic acid；5.methyl acetylsalicylate；6.MA-2；7.MA

表1 定量限与检测限测定结果Tab 1 Determination results of quantitation limit and detection limit

3 讨论

MA是DHMEQ合成过程中一个重要的中间体，其纯度对后续中间体和终产品的质量有显著影响，所以有必要进行其纯度控制。作为中间体，MA纯度测定结果是以峰面积归一化方法计算，故不受仪器精密度、准确度影响，因而未进行精密度、准确度等验证，只需按照2015年版《中国药典》[4]限度方法学要求验证专属性、检测限、耐用性足以保证本方法的可靠性。此外，MA生产后很快就投入下一步的反应中，无需长期放置，故其纯度测定方法的专属性验证重点考察分离度、溶剂干扰试验，不进行降解试验。

综上所述，本方法专属性、检测限、耐用性均符合要求，可用于DHMEQ中间体MA及其杂质的检测。

[1] Matsumoto N，Ariga A，To-e S，et al.Synthesis of NF-κB activation inhibitors derived from epoxyquinomicin C [J].Bioorg.Med.Chem.Lett，2000，10（9）：865.

[2] Yamamoto M，Horie R，Takeiri M，et al.Inactivation of NF-κB Components by Covalent Binding of（-）-Dehydroxymethylepoxyquinomicin to Specific Cysteine Residues[J].J Med Chem，2008，51（18）：5 780.

[3]Horie R，Watanabe T，Umezawa K.Blocking NF-kappa-B as a potential strategy to treat adult T-cell leukemia/lymphoma[J].Drug News Perspect，2006，19（4）：201.

[4] 孙婷，杨浩天，刘红莉，等.HPLC法测定洛伐他汀分散片中的有关物质[J].中国药房，2016，27（12）：1 683.

Determination of DHMEQ Intermediates MAand Its Impurity by HPLC Method

HU Keyu，WANG Yanfeng，YU Weilin，MA Jun，DENG Shuangbing（Shenzhen WanHe Pharmaceutical Co.Ltd，Guangdong Shenzhen 518057，China）

OBJECTIVE：To establish a HPLC method to determine DHMEQ intermediate N-（2-acetoxybenzoyl）-2，5-dimethoxyaniline（MA）.METHODS：The column was Utimate AQ-C18with mobile phase of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1 ml/min，detection wavelength was 230 nm，column temperature was 30Ⅱ，and the injection volume was 10 μl.RESULTS：The separation degrees of MA and the impurities were above 1.5，the number of theoretical plates（calculated with MA peaks）was no less than 5 000，retention time was about 41 min；the detection limits（the percentages of MA samples）of MA，methyl acetylsalicylate，SM2，SM1，MA-6，salicylic acid and MA-2 were 0.04%，0.03%，0.01%，0.05%，0.05%，0.05%and 0.05%；detection limits（the percentage of MA samples）were 0.01%，0.01%，0.004%，0.02%，0.02%，0.02%and 0.02%，respectively；the stability of solution and durability of method were good.CONCLUSIONS：The specificity，detection limit，and durability of the method are all in line with the requirements，which can be used for DHMEQ intermediate MA and its impurity.

DHMEQ；Intermediate；N-（2-acetoxybenzoyl）-2，5-dimethoxyaniline；Impurity；HPLC

R927

A

1001-0408（2016）36-5125-03

2016-09-21

2016-11-07）

（编辑：刘 柳）

国家科技重大专项——重大新药创制项目（No.2012ZX09103101-004）；广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目（No.2012A080800010）；深圳市技术研究开发计划（三大产业）项目（No.JSA201105090126A）

＊工程师。研究方向：药品质量、项目管理及注册申报。E-mail：hukeyu@wanhe-phar.com

#通信作者：工程师，硕士。研究方向：药品质量、项目管理及注册申报。E-mail：dengshuangbing@wanhe-phar.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.26