第三代自体软骨细胞移植术研究进展

林威　陈洁琳　朱伟民　王大平

510182，　　广州医科大学深圳市第二人民医院临床学院(林威)；518035，　　深圳市运动医学技术工程研究中心(林威、陈洁琳、朱伟民、王大平)；518035，　　深圳市组织工程重点实验室(林威、陈洁琳、朱伟民、王大平)



第三代自体软骨细胞移植术研究进展

林威陈洁琳朱伟民王大平

510182，广州医科大学深圳市第二人民医院临床学院(林威)；518035，深圳市运动医学技术工程研究中心(林威、陈洁琳、朱伟民、王大平)；518035，深圳市组织工程重点实验室(林威、陈洁琳、朱伟民、王大平)

摘要关节软骨损伤后自我修复能力十分有限。传统治疗如微骨折术等效果往往不理想。自体软骨细胞移植术是目前修复软骨缺损效果最佳的治疗手段，其中第三代自体软骨细胞移植显示出较前两代技术更佳的疗效和前景。随着组织工程技术及材料学、细胞生物学等发展，第三代自体软骨细胞移植术出现改良方案，其各具特点及优势。该文就第三代自体软骨细胞移植术研究进展作一综述。

关键词软骨损伤；自体软骨细胞移植；组织工程；支架

关节软骨缺乏血管、神经和淋巴组织，一旦损伤便难以修复，其生物力学也随之改变[1]。传统的治疗手段包括关节灌洗、骨髓刺激术、软骨移植术和人工关节置换术等。其中骨髓刺激术最为常用，其通过钻孔、微骨折等方式引导骨髓腔内的骨髓间充质干细胞至缺损表面达到修复再生的目的，然而临床研究证实这种再生软骨为纤维软骨，其生物力学性能和黏弹性较透明软骨差[2]。软骨移植术后再生软骨多为透明软骨，但供区软骨来源有限、操作困难等限制其广泛应用[3]。Brittberg等[4]为寻求更理想的透明软骨修复效果，于1994年首次尝试应用细胞技术修复软骨，取非负重区软骨分离出的软骨细胞并将其体外扩增培养，然后将细胞悬液注射至缺损处以自体骨膜覆盖并严密缝合，此为第一代自体软骨细胞移植术(P-ACI)。然而，P-ACI因骨膜增生、供区受损等而应用受限，以胶原膜替代骨膜的第二代自体软骨细胞移植术(C-ACI)应运而生[5]。多数研究表明，C-ACI疗效较微骨折术、软骨移植术好，组织学检查发现其再生软骨多为透明软骨，但C-ACI易出现细胞漏渗、骨膜增生、细胞去分化等[6]。为解决上述缺陷，出现了第三代自体软骨细胞移植术，即以基质诱导的自体软骨细胞移植术(MACI)[7]。MACI首次将软骨细胞种植于过渡性支架上，然后将复合细胞的支架植入缺损处，避免了细胞漏渗，同时支架为细胞提供了临时三维生长空间，有利于软骨细胞表型维持和生长[8]。随后出现了许多改良技术，如 Hyalograft C、Bioseed C、NeoCart等，此类技术修复效果显著，并已获批准运用于临床。

1经典MACI

Behrens等[9]首次提出MACI，该技术将体外扩增的自体软骨细胞种植于猪来源的Ⅰ/Ⅲ型双层胶原膜，移植时将粗糙面贴近缺损面，然后以生物蛋白胶结合缝合方式进行固定。Basad等[10]报道65例MACI关节镜患者中期随访结果，结果显示早期Tegner评分、Lysholm评分显著提高并持续至术后第5年，MRI检查提示缺损填充良好。Aldrian等[11]在长期随访中发现，MACI治疗有症状的中重度关节软骨缺损安全有效，术后5年内患者疼痛、功能及活动水平等均有明显改善，影像学检查提示患者术后组织修复好，与附着物结合紧密。对比研究发现，MACI较经典微骨折术更具优势。Saris等[12]对144例有明显临床症状的软骨缺损患者(缺损面积≥3 cm2)进行随机对比研究发现，MACI患者术后改善显著。Basad等[10]进行40例MACI与20例微骨折术后2年随访对比研究，结果MACI患者Lysholm评分、Tegner评分、国际软骨修复协会(ICRS)评分明显优于微骨折术患者。然而，MACI尚未表现出较P-ACI和C-ACI明显的优势。Benthien等[13]在一项大样本调查中发现，MACI与P-ACI、C-ACI疗效相近，但MACI在技术上更具优势。其他类似研究[14]也表明MACI与P-ACI、C-ACI疗效无明显差异。

2 改良MACI

2.1Hyalograft C技术

Hyalograft C技术以透明质酸苄基酯凝胶为支架，可在关节镜下完成手术，目前其应用广泛程度仅次于经典MACI。透明质酸属于天然聚阴离子黏多糖，具有独特的流变性能和良好的生物相容性，存在于人体所有的疏松结缔组织中[15]。透明质酸在葡萄糖醛酸与苄基乙醇作用下酯化生成透明质酸苄基酯凝胶，透明质酸苄基酯凝胶较透明质酸支撑强度强、降解速率慢。体外实验[16]证实，透明质酸苄基酯凝胶对软骨细胞表型的维持具有优势且对细胞黏附和增殖具有诱导作用。Kon等[17]对50例Hyalograft C患者进行长达5年的追踪随访，结果显示所有患者临床评价指标均明显好转，MRI检查显示移植物边缘整合和缺损填充良好，并发现有规律的运动对临床评价指标、再生软骨表面情况有积极的影响。Brix等[18]对53例Hyalograft C患者进行长达平均9年的随访，结果显示术后患者所有临床康复指标均显著改善，其中10年随访组(13例)国际膝关节文献委员会膝关节评估表(IKDC)评分由术前40.4分提高至74.7分(P<0.05)。尽管Hyalograft C治疗效果得到广泛肯定，但因无法提供足够的证据说明其获益大于风险，Hyalograft C目前已从欧洲市场退出[19]。

2.2Bioseed C技术

Bioseed C技术的移植材料主要为纤维蛋白水凝胶，经由聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、聚二恶烷烔等化学改造，改造后支架孔隙率增大、力学强度提高。该技术采取特殊的固定方式，即仔细清创修整软骨缺损为矩形，将移植物裁剪成相匹配的形状，移植物4个角经可吸收线缝合至软骨下骨来达到有效的固定作用，确保即使缺损周围软骨移植物不完整也不会发生松动[20]。Ossendorf等[21]报道40例Bioseed C患者2年随访结果，其中膝关节损伤与骨关节炎评分(KOOS)、Lysholm评分、改良辛辛那提膝关节评分和生活治疗调查问卷(SF-36)评分明显提高，组织学活检显示移植物与周围组织整合良好。Kreuz等[22]报道了52例Bioseed C患者术后平均4年的随访结果，其中KOOS、IKDC、Lysholm和ICRS评分较术前明显提高，MRI检查提示软骨缺损填充良好，表明Bioseed C技术是修复膝关节局部退行性缺损的有效治疗手段。

2.3NeoCart技术

NeoCart技术将软骨细胞种于Ⅰ型胶原构建的蜂巢样基质中并置于特制的模拟关节力学环境的反应器培养1周，再体外三维静态培养2周(必要时可达4周)，得到的移植物含有丰富的蛋白多糖和黏多糖，最后经小关节切口植入缺损区，采用生物黏合剂固定[23]。Crawford等[24]首次报道了8例应用NeoCart技术的患者，术后随访2年，结果IKDC评分明显提高，MRI检查显示软骨缺损填充良好。他们[25]在随后进行的美国食品药品监督管理局(FDA)第2期临床审核中对比了20例NeoCart患者与10例微骨折术患者，结果显示NeoCart技术安全性类似微骨折术，却具有更显著的临床效果。目前NeoCart技术尚处于FDA第3期临床审核阶段[26]。

2.4 Cartipatch技术

Cartipatch技术采用由琼脂糖和藻酸盐构成的温固化水凝胶为支架，该材料在室温下为溶胶状态，内部具有丰富的网状结构，回植时与软骨细胞悬液均匀混合，被注射至软骨缺损处后，体温下可迅速转变为凝胶态，最后以生物胶水固定[23]。琼脂糖凝胶化后具有三维多孔结构，但其防粘连特性可干扰细胞黏附，因此需与藻酸盐等天然材料复合，降低其防粘连性且优化支架的力学性能和成型性能[27]。Selmi等[28]报道了17例经Cartipatch技术治疗的软骨缺损患者，分别从临床、影像学、关节镜下和组织学方面进行评价，随访2年，结果所有患者临床症状均得以显著改善，平均国际关节镜下软骨修复评分为10分(最高12分)，13例行组织学检查的患者中有8例(62%)可见显著的透明软骨，表明由琼脂糖与藻酸盐组成的水凝胶不仅可以修复较大、较深的软骨缺损，而且在操作上较便捷。

2.5Novocart 3D技术

Novocart 3D技术以三维胶原-硫酸软骨素为支架。硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上的一类糖胺聚糖，广泛分布于细胞外基质和细胞表面。硫酸软骨素经胶原交联化学改造后抗原性和降解速率降低，同时更能模拟软骨细胞外基质的特性[29]。该技术使用生物可吸收螺钉固定，便于关节镜下操作。Zak等[30]报道了23例Novocart 3D患者术后2年的随访结果，结果KOOS、IKDC、Tegne等评分明显提高，MRI检查显示移植物填充良好。该技术目前尚缺乏中长期随访研究结果。Niethammer等[31]对30例Novocart 3D患者随访3年，结果IKDC评分较术前明显提高，MRI检查显示缺损区新生软骨填充良好，信号与邻近正常软骨组织相似。

2.6CaReS技术

CaReS技术以鼠尾Ⅰ型胶原蛋白为支架，鼠尾胶原是天然的培养基，其浓度>1 mg/mL时可形成一定强度的三维凝胶[32]。该技术在低温条件下将鼠尾胶原与软骨细胞悬液均匀混合，加入自体血清，室温下待生成凝胶后置于培养箱里培养2周。Schuttler 等[33]对15例CaReS患者随访4年，结果显示IKDC评分、疼痛视觉模拟评分(VAS)、软骨修复MR评分(MOCART)在后期显著提高。Petri等[34]比较CaRes技术与微骨折术，尚未发现CaRes技术明显的优势，其疗效有待进一步研究证实。

3支架材料

无论是经典MACI技术，还是随后出现的Hyalograft C、Bioseed C、NeoCart、CaReS等批准临床运用的方法，它们所选用的支架主体都是天然材料，以软骨基质成分如胶原、透明质酸、硫酸软骨素、纤维蛋白等居多[35]。这类物质早已作为其他用途用于临床治疗，其生物相容性和安全性毋庸置疑。尽管人工材料力学性能优于天然材料，但其安全性有待证实。目前唯一获得FDA认可的PLGA类人工合成材料也较少单一用于组织工程，通常复合其他天然材料来弥补支架所需的细胞识别信号及仿生效果[36]。

4结语

MACI是支架、种子细胞和生长因子三大要素的有机结合。天然支架具有独特的细胞识别信号、良好的生物相容性和仿生效果，目前众多技术仍选用天然材料作为支架主体。有学者针对支架部分提出改进，试图发现或研发更适合软骨细胞生长、能完美解决其去分化现象、更匹配的降解速率和优越的过渡期生物力学性能的三维支架。水凝胶的出现、温控和光敏材料的应用使得关节镜下注射修复关节软骨成为可能，并可缩短手术时间和减少术后并发症发生率。尽管这些新型材料均有满意的临床疗效，但目前为止尚未有哪种修复可以获得健康软骨的所有特性，且该技术缺乏大样本、中长期的随访结果。近期有学者研究种子细胞来源问题，其中胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带干细胞等备受关注，也有学者关注生物反应器对构建组织工程软骨的优势。相信随着多学科的交汇，将会出现更多解决软骨修复的新技术。

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(收稿：2015-09-14; 修回：2015-12-23)

(本文编辑：卢千语)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.003

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81572198)、广东省自然科学基金(2015A030313772)