特异性抗神经元抗体对副瘤性神经系统综合征及癌症的预测和早期诊治价值



特异性抗神经元抗体对副瘤性神经系统综合征及癌症的预测和早期诊治价值

陈齐鸣

副瘤性神经系统综合征(paraneoplastic neurological syndromes,PNS)是一种与恶性肿瘤密切相关的神经系统疾病。它既非癌肿的直接侵犯、压迫及转移所至，也不是由于癌肿导致的代谢障碍、感染、血管性疾病、恶病质及放疗和化疗的并发症引起的中枢神经系统(CNS)损害,往往是一种很小的固体肿瘤或处于癌前期阶段的肿瘤而导致的神经系统的远隔症状。因而PNS可在肿瘤发生前或与肿瘤同时也可在肿瘤发生后或在肿瘤复发时出现。与PNS相关的恶性肿瘤主要见于小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[1-2]、乳腺癌、卵巢癌等妇科肿瘤[3]，还可见于前列腺癌、食管癌、卵巢畸胎瘤、结肠癌、白血病、胸腺瘤、黑色素瘤、睾丸癌、非何杰金氏淋巴瘤等其它癌肿。近年来由于发现了部分PNS患者血清和脑脊液(CSF)中存在特异性抗神经元抗体，如抗-Hu抗体(ANNA-1)、抗-Yo抗体(PCA-1)、抗-Ri抗体(ANNA-2)、抗CV2抗体、抗-Amphiphysin抗体及抗-Ma2/TA[3-5]六种确定性抗体，从而认为PNS发病机制可能与自身免疫有关，引起国内外医学界对此病的强烈关注，并进行了深入而广泛的研究。

在上述PNS患者自身抗体中，抗-Hu抗体研究较为详细。抗-Hu抗体是一种多克隆IgG抗体，主要与中枢及外周神经元和小细胞肺癌细胞核中一种相对分子量为35 000-40 000的蛋白结合，与细胞质反应轻微，不与核仁反应[3-5]。与抗-Hu抗体结合的蛋白为RNA结合蛋白的大家族，用抗-Hu抗体筛选人cDNA文库可以得到三种不同的目的基因，产生HuD、HuC和Hel-N1三种基因产物，HuD为一种高度保守的人类神经元的RNA结合蛋白，包括3个RNA结合位点，在mRNA编码蛋白质中其重要作用，参与神经元mRNA前体的剪接、细胞定位和稳定，维持神经元的表现型及神经系统的正常分化和发育[6]。

在SCLC等多种癌肿的癌细胞中含有神经内分泌颗粒，内有HuD蛋白，具有内分泌和化学受体功能，并能诱导针对HuD蛋白的自身抗体，产生多种PNS。SCLC患者无论是否发生PNS，癌细胞中都有HuD蛋白的高度表达，并发PNS的患者，其血清中都有高滴度Hu抗体，且2/3患者Hu抗体出现在SCLC潜伏期中。有抗-Hu抗体的SCLC患者预后较好，生存期较长，而且早期发现的SCLC的患者易得到根治，但有些PNS患者往往是由于神经系统早期严重损伤而致残。因此，对SCLC的HuD抗原激发的PNS进行深入研究，特别是探索免疫学的发病机制，对于PNS及SCLC的早期诊治有重要意义。

1PNS与体液免疫

Vega F[7]等用Schuller数学公式对16例副瘤性脑脊髓炎(PEM)和14例副瘤性亚急性感觉性神经元病(SSN)患者抗-Hu抗体的鞘内合成进行了计算并进行了比较，发现PEM患者CSF中有高滴度抗体88%存在鞘内合成，而SSN为7%，两者相比有极大的差异(P<0.0001),该结果支持PNS是一种体液免疫密切相关的自身免疫性疾病。de Graaf等[8]用流式细胞评估伴有抗-Hu抗体阳性的PNS患者(Hu-PNS)中的主要淋巴细胞亚群，与对照组比较，Hu-PNS患者CSF中B细胞亚群显示出显著的绝对值和相对值增多，CD4+、CD8+和NK细胞数仅显示绝对值增多，在Hu-PNS的血与CSF中，相对的B细胞增多与抗-Hu抗体的鞘内合成结果一致。

Greealee等[9]认为抗-Hu抗体是副瘤性的免疫球蛋白，可识别所有神经元中的细胞核抗原，发现IgG抗体能够进入神经元内并与神经元胞内蛋白起反应，可导致神经元不可逆的死亡。用抗Hu血清进行大鼠的海马与小脑脑片培养，即时评价神经元抗体的摄取和延迟培养过程中神经元的死亡，为测试抗-Hu抗体的特异性细胞毒效应，将靶抗原HuD吸附前与吸附后抗-Hu抗体的IgG血清与大鼠脑片培养。结果发现：(1)大鼠海马及小脑神经元快速摄取抗-Hu抗体；(2)抗体在活的神经元中被摄取；(3)在细胞内结合的抗-Hu抗体导致神经元死亡；(4)用HuD吸附抗-Hu抗体后显著减少神经元内的IgG聚集并且消除了细胞毒作用。确认抗体介导的神经元死亡的特异性。抗-Hu抗体导致神经元死亡的现象是Hu-PNS患者发生神经系统不可逆损伤的主要原因。

2PNS与细胞免疫

实验室研究表明，通过激活的CD8+T细胞加入γ-干扰素共同孵育可以溶解自身注入HuD抗原的纤维母细胞[10]。

Tanaka[11]认为PNS是由恶性肿瘤触发的自身免疫过程，针对的靶抗原是肿瘤和中枢神经系统(CNS)细胞核共同抗原。攻击细胞内蛋白的特异性神经元抗体可能导致细胞毒T淋巴细胞(CTL)介导的细胞死亡。目前有下列发现支持这一假说：(1)脑脊液中单核细胞突出占优势；(2)在肿瘤和神经组织中有炎性细胞的侵润，主要是CD8+T淋巴细胞；(3)在CNS病灶中，利用T细胞受体检测侵润的T淋巴细胞是寡克隆的;(4)仅仅抗细胞内蛋白抗体如抗-Hu抗体并不能产生疾病模型;(5)Hu-PNS周围血中的单个核白细胞(PBMC)分离CD8+T细胞中可诱导产生具有活性的CTL;(6)Hu-PNS具有共同人类白细胞Ⅰ型抗原(HLA)决定簇，表明Hu-PNS在细胞表面提交某些抗原多肽可刺激CD8+T细胞，作为效应细胞攻击靶组织。抗原特异性的C TL介导的细胞死亡是将来建立肿瘤免疫和PNS神经疾病动物模型潜在的研究方向。

De Jongste[12]利用多参数流式细胞仪对11例新诊断为Hu-PNS患者血清与CSF配对标本中的淋巴细胞亚群及树状突细胞进行了研究，与9例其它炎症性神经系统疾病，12例其它神经系统疾病进行对照，患者CSF中的调节性T细胞、中央记忆T细胞、类别转换性B细胞和树状突细胞升高。这些研究结果支持Hu-PNS局部激活免疫系统，提示Hu-PNS和其它炎症性CNS疾病有共同的致病途径。

3尚未解决的科学问题和国内研究现状

上述研究虽然有所见解和收获，但是确缺乏深入系统和广泛的研究，很多的现象无法用现有的理论去解释。目前发现相同的肿瘤HuD抗原导致的PNS的表现型差异性较大，如：(1)70%的恶性肿瘤患者在确诊前就出现PNS[13]。(2)抗-Hu抗体与SCLC和PNS三者的组合中有多种表现型，PNS可累及CNS和周围神经系统各个不同部位神经元造成损害,如亚急性感觉性神经元病是以周围神经损害为主，而边缘叶脑炎是以大脑颞叶海马的神经元损伤为主[13-15]；(3)SCLC伴抗-Hu抗体的患者,肿瘤生长隐匿,肿块通常很小,生存期较一般肿瘤患者延长，而且可以缓解，预后较好，提示HuD抗原激发的免疫效应不仅仅损伤CNS，也有显著的抑瘤效应[3，16-17]；(4)不同的肿瘤如十二指肠神经内分泌肿瘤、肺腺癌、乳腺癌等可产生相同的抗-Hu抗体和不同的PNS[18-19]。上述种种谜团尚未得到解决。

我们在原国家教育部、安徽省人事厅、科技厅、教育厅、卫生厅以及法国巴黎居里大学Salpêtrière医学院附院Dlattre教授及法国医科院神经分子免疫实验室(INSERMU 134)Schuller教授的大力支持下于1993年开展了对PNS的临床及免疫学研究，在国内报道3种特异性神经元抗体与PNS的临床表现、临床分型及相关肿瘤之间的关系，建立了实验室免疫学诊断标准，开展了对抗-Hu、抗-Yo及抗-Amphiphysin抗体的检测，发现PNS/SCLC患者血清中抗-Hu抗体滴度高达1：64 000,CSF中高达1：4 000，尿液中高达1：200，在患者CNS中存在特异性抗体合成，抗体特异活性明显增高[19]。采用流式细胞术检测10例PNS患者外周血T细胞亚群、活化及调节性T细胞，并与正常人及SCLC患者比较，发现PNS患者外周血CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+降低，活化T细胞增多及调节性T细胞减少。提示其细胞免疫功能总体处于低下状态；并有T细胞过度激活及调节性T细胞所介导的免疫抑制功能的降低[20]。针对PNS患者外周血单个核白细胞(PBMC)的增殖反应及其对SCLC细胞株(H446)的抑制作用发现PNS患者的PBMC经白介素-2刺激后，患者CD4+比例(76.54±3.96)%较正常对照组(51.75±7.3)%显著升高(P<0.05),所以PNS患者PBMC增殖反应以CD4+T细胞为主[21]。国内外的研究结果均表明PNS与自身肿瘤抗原导致的自身免疫有关。

4科学假设

HuD抗原在PNS自身免疫致病过程中可能起激发作用，导致机体产生体液免疫出现高滴度的特异性神经元自身抗体，产生体液免疫作用于中枢神经元，另一方面也激发宿主CNS中的特异性细胞免疫，涉及到某些T细胞亚群如CD4+，CD8+，Th17/Treg调节性T细胞及NKT细胞。宿主体内发生的自身免疫反应对患者一方面有保护作用，抑制和杀伤自身肿瘤细胞，使高度恶性SCLC很少转移。另一方面却把自身中枢神经元误认为肿瘤细胞，造成自身神经元损伤，而导致多种CNS和周围神经系统副瘤综合征。针对上述现象,我们对于HuD激发的PNS的免疫学发病机制提出以下几种假设:(1)抗-Hu抗体是多克隆免疫球蛋白IgG，识别神经元中的胞核抗原，抗体能够主动进入CNS和周围神经系统神经元内并与神经元胞内蛋白HuD起反应，直接导致神经元不可逆的死亡;(2)特异性神经元抗体和CTL共同作用于CNS的不同部位神经元死亡而导致PNS异质性;(3)PNS患者个体免疫应答机制不同，存在明显的辅助性T细胞亚群(Th1/Th2,Th17/Treg)之间平衡失调，而产生自身免疫的病理过程。

为阐明PNS发病机制及早期诊治PNS及相关的恶性肿瘤找到新的突破口，本课题拟采用如下方法和技术：(1)制备神经元核蛋白HuD基因产物为激发抗原，刺激伴有SCLC的Hu-PNS患者体内抗原特异性T细胞亚群并进行分析；(2)分析HuD抗原刺激前后的Th1/Th2，Th17/Treg失衡；(3)采用活细胞荧光染料CFSE标记法测定淋巴细胞针对照射后SCLC细胞的增殖反应；(4)采用碘化丙酊和CFSE双标记法测定HuD特异性效应T细胞对SCLC细胞的毒性作用；(5)应用ELISPOT技术，测定特异性T细胞克隆；(6)建立人SCLC种植裸鼠动物模型，观察抗-Hu抗体和/或HuD特异性T细胞在活体内对宿主CNS的破坏作用及对肿瘤细胞的杀伤作用。

5科学意义

目前国内外对该项目基础理论研究比较薄弱，因而积极深入探讨PNS的免疫学发病机制，以达到早期诊断PNS、阻断自身免疫系统对宿主CNS损伤、提高抗肿瘤免疫的作用，期望最终达到预防或者治愈这种致残率死亡率较高的疾病并发掘全新的抗肿瘤的治疗方法。

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[作者单位] 蚌埠医学院第一附属医院 神经内科,安徽 蚌埠 233004

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收稿日期：(2015-11-26)

DOI：10.14126/j.cnki.1008-7044.2016.01.001

[作者简介]陈齐鸣(1956-)，男，教授/主任医师，研究生。