抗体亲和力试验的研究进展

蓝翊文 秦 月

(1 中华人民共和国凭祥出入境检验检疫局，凭祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁市 530028)

综 述

抗体亲和力试验的研究进展

蓝翊文1秦 月2

(1 中华人民共和国凭祥出入境检验检疫局，凭祥市 532600，E-mail：735292951@qq.com；2 广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁市 530028)

近年来，不少学者应用快速、准确、敏感的抗体亲和力试验鉴别病原体的原发感染和既往感染，解决相关疾病由于免疫等原因出现不典型症状的难题，为临床制定预防和治疗措施提供科学依据。抗体亲和力检测技术的日益成熟，为疾病检测开启了新篇章。本文对近年来该技术的实验研究及应用作一综述。

抗体亲和力；抗原；感染；免疫；综述

抗体亲和力是指抗体分子的抗原结合位点与对应的抗原表位之间存在的引力，是抗原抗体之间固有的结合力，代表了两者之间特异结合的紧密程度。抗体随着机体初次接触抗原时间的推移而逐渐成熟，初期抗体与抗原结合力较弱，即为低亲和力抗体，随着抗体的成熟，其亲和力增加；当加入能降低抗原抗体结合力的物质(如尿素)时，低亲和力抗体被洗脱，而高亲和力抗体基本不受影响[1]。借此原理能建立检测抗体亲和力的方法，根据其的强弱可以大致判断病原体感染的时间，确定是初次感染，即原发感染，或者是既往感染(包括继发感染)。

抗体亲和力因具有快速、准确、敏感的特点而备受学者关注。近年来，不少学者应用抗体亲和力试验鉴别病原体的原发感染和既往感染，解决相关疾病由于免疫等原因出现不典型症状的难题，为制定预防和治疗措施提供科学依据。不仅如此，根据其鉴别原发/继发感染的特点，抗体亲和力试验还可准确预测宫内感染的发生，以便临床及时采取处置措施，降低新生儿出生缺陷的发生率[2-4]。抗体亲和力检测技术的日益成熟，为疾病检测开启了新篇章。本文对近年来该技术的实验研究及应用作一综述。

1 抗体亲和力试验的原理与检测方法

1.1 基本原理 抗体亲和力试验前身是1989年Hedman等[5]为产前诊断风疹病毒而建立的尿素变性试验。其基本原理是人体初次接触抗原后，随着时间推移B细胞不断成熟，逐渐生成高亲和力抗体；在尿素变性处理下，免疫初期产生的低亲和力抗体会从抗原抗体复合物中解离出来，而后期产生的高亲和力抗体仍与抗原牢固结合。通过低亲和力及高亲和力抗体的构成比可有效判别初次感染和既往感染。

1.2 常规检测方法 以Hedman等[5]发明的测定风疹病毒抗体亲和力的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法最具代表性：(1)在包被好风疹病毒抗原的酶标板中加入8 mol/L的尿素溶液；(2)血清样本经磷酸盐缓冲液(phophate buffer solution，PBS)-Tween缓冲液1 ∶100稀释后加入酶标板中，每份血清平行加两孔，37℃反应2 h后，一孔用PBS-Tween缓冲液洗涤3次，另一孔用加有8 mol/L尿素的PBS-Tween溶液洗涤3次，均每次浸泡5 min；(3)加入抗RV-IgG的碱性磷酸酶，37℃反应1 h，未被洗脱的抗RV-IgG则能与之结合，后用PBS-Tween洗涤3次，每次浸泡5 min；(4)加入显色剂后用NaOH 终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度值(OD值)。计算亲和力指数(avidity index，AI)，AI=经尿素处理的样本OD值/相应未经尿素处理的样本OD值×100%。1.3 AI的临床意义 AI值大小反映出特异性抗体的亲和力高低，应用到临床上可判断获得性感染时间的长短。目前针对抗体亲和力检测研究的文献大多采用Hedman等[5]报告的判定标准：AI<30%为低亲和力抗体，表示原发感染；30%～50%为中等亲和力抗体，表示可能与病原体既往原发感染有关；AI>50%为高亲和力抗体，表示既往感染。这一标准也同样被应用到其他病原体的检测上，如Tuokko等[6]对麻疹病毒的检测，其也是以AI<30%判定为低亲和力抗体，AI>50%判定为高亲和力抗体。

2 抗体亲和力试验技术的发展

2.1 变性剂的使用 尿素是亲和力试验中最常用的变性剂，早期研究发现6 mol/L和8 mol/L尿素均能有效鉴别近期感染和既往感染[7]。而Condorelli等[8]对6 mol/L和8 mol/L尿素的洗脱效果比较发现，使用6 mol/L尿素时，风疹患者在出疹后第3天和第46天的AI由16%上升至51%；而使用8 mol/L尿素时，亲和力由13%变为36%，亲和力上升缓慢，说明6 mol/L尿素能在感染后更早的检测出低亲和力抗体。此后的实验较多以6 mol/L尿素代替8 mol/L尿素。

其他变性剂如异硫氰酸胍、柠檬酸、硫氰酸铵、二乙胺和盐酸胍等在抗体亲和力试验中亦有使用。异硫氰酸胍腐蚀性强，对仪器损害大；柠檬酸(pH=3.0)解离效率好，腐蚀性小，对仪器损害小，相对较安全[9]。有学者将变性剂硫氰酸铵、二乙胺、盐酸胍与尿素进行比较研究发现[10]：8 mol/L尿素组敏感性为 63.6%(7/11)，特异性为95.0%(19/20)； 35 mmol/L二乙胺组敏感性为72.2%(8/11)，特异性为95.0%(19/20)；4 mol/L盐酸胍组敏感性为63.6%(7/11)，特异性为80.0%(16/20)；3 mol/L硫氰酸铵组敏感性为9.0%(1/11)，特异性为100%(20/20)。此实验结果显示：35 mmol/L二乙胺较8 mol/L尿素效果好，其余两种变性剂效果不佳，但由于二乙胺极度易燃，具腐蚀性、强刺激性，可致人体灼伤，故实际使用效果没有尿素好。2.2 血清稀释度的选择 在弓形体AI试验中，Bonyadi等[11]按商品化试剂盒要求，对待检样本做初始稀释后，继续按1/3、1/6、1/9和1/18倍数稀释血清，各稀释血清分尿素处理组和未处理组，再进行余下的ELISA反应和测定计算AI值。结果发现当样本中的特异性IgG抗体初始浓度大时，其相应的最佳稀释度也越高；提示样本中抗体起始浓度的高低直接影响到其AI值的大小，选择最佳的样本稀释度可避免高浓度IgG抗体样本可能导致的假阴性结果。

Jenum等[12]弓形体AI检测试验中也遇到此问题，于是将血清标本分别做两个系列稀释，一组做1 ∶50、1 ∶200和1 ∶800稀释，然后用6 mol/L尿素洗脱来测定其ELISA的OD值；另一组做1 ∶200、1 ∶800和1 ∶3 200稀释，但用试剂盒所配洗液洗脱测其OD值。最后将这两组OD值带入专门编制的终点滴度法公式，来计算其AI值。此方法解决了待检样本中抗体总量不同导致亲和力测定结果不同的问题。

2.3 AI临界值的设定 虽然Hedman等[5]对风疹病毒抗体AI临界值设定的思路同样适用于其他病原体感染分析，但不同的待检病原体、不同的实验条件及不同的试验方法，都会有各自特定的AI临界值。Revello等[13]以近期感染(<90 d)和过去感染(≥90 d)及反复感染人群为对象，研究巨细胞病毒感染的AI临界值设定标准。按试剂盒要求以AI临界值<20%判定为低亲和力时，其判断近期感染的灵敏度为92.8%；而若将AI临界值改为<30%，则灵敏度变为100%，而且检测的特异度不变。可见AI临界值随试验不同而改变，应根据不同的试验条件摸索出对应的临界值标准。

2.4 其他检测技术的发展 除了传统尿素变性法外，限制性抗原亲和力酶联法(limiting antigen avidity enzyme immunoassay，Lag-Avidity EIA)和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)亦有应用。Lag-Avidity EIA法[14]原理为：抗原浓度较高时，高亲和力和低亲和力抗体的均有机会与抗原结合；当抗原浓度低时，抗原首先选择与高亲和力抗体结合，而低亲和力的抗体与抗原结合不稳定，甚至不能与抗原结合。但是包被极低浓度的抗原难度较大，且检测结果不稳定。经试验，Lag-Avidity EIA法找到的最佳包被抗原浓度为0.063 μg/ml，在此浓度下，低亲和力抗体与抗原结合不牢固，且在加入pH为3.0的柠檬酸后，能进一步阻止低亲和力抗体与抗原结合，而高亲和力抗体不受影响。据此区分低亲和力和高亲和力抗体，来判断原发感染和既往感染。有学者[15]对比传统尿素法和Lag-Avidity EIA法检测艾滋病抗体阳转者血清的亲和力变化情况，发现这两种检测方法有较好一致性；但AI法要求平行双孔，而Lag-Avidity EIA法只需单孔检测，操作相对简单。IFA法用荧光标记的抗IgG抗体代替酶标记的抗IgG抗体，与待测血清中的IgG抗体结合反应后，在荧光显微镜下观察结果[16]。由于荧光色泽与背景色泽对比鲜明，含低亲和力IgG抗体的血清用尿素处理后，可观察到荧光强度明显下降。实验相关性和一致性分析表明，低亲和力IgG抗体水平与IgM抗体水平显著相关(P<0.05)，且一致性较好。但结果易受非特异荧光的干扰，需设计较多的试验对照。

3 抗体亲和力试验的应用

3.1 鉴别原发感染 目前有较多种类的传染病原发感染检测应用了抗体亲和力试验，如风疹病毒[5]、巨细胞病毒[1-2，4]、弓形体[3]、艾滋病病毒[17]、单纯疱疹病毒[18]等的检测。在以往的实验室检测中，IgM阳性为判断新近感染和活动期感染的指标。但在一些病原体被清除后，IgM抗体可能于较长时间以低浓度状态存在；而另一些病原体在急性感染后，IgM抗体较早消失。因此，IgM抗体检测存在出现假阳性或假阴性结果的可能。而且在继发感染时也可能出现IgM抗体，故单靠IgM抗体判断病原体的原发感染有一定的局限性[19]。另外，采集急性期和恢复期双份血清，恢复期IgG抗体滴度在急性期的4倍以上亦可判断是否为新近感染。但患者难于接受双份血清的采集，且间隔较长时间的采样也较难实施[20]。相关分子生物学技术如PCR法亦可作为原发感染的辅助检测手段，但其检测的时效性受限于病原被机体清除前，且病原体如被长期携带则无法鉴别。

随着抗体亲和力试验技术的不断成熟，其被认为是判断原发感染较为可靠的诊断方法。有研究表明[21]：在巨细胞病毒IgM阳性患者中只有14%～18%能检出低亲和力IgG，在判断是否为巨细胞病毒近期感染时，抗体亲和力试验的特异性明显高于单纯IgM抗体检测。有学者研究认为怀孕6～18周的巨细胞病毒IgG亲和力试验诊断原发感染敏感度为100%，而IgM的诊断敏感度只有69%[22]。因此，抗体亲和力试验不仅可鉴别初次感染和二次感染，还可排除初次感染后几个月或几年残存有IgM抗体的可能。

3.2 优生优育 抗体亲和力检测技术在诊断宫内感染及优生优育方面应用最广。风疹病毒、人巨细胞病毒和弓形体这类病原体在人类多呈无症状感染或亚临床症状，孕妇感染此类病毒后，特别是早期原发感染，易通过胎盘传给胎儿，造成新生儿先天畸形，视力听力障碍和智力障碍等严重症状。前瞻性研究发现[23]：我国人巨细胞病毒阳性母亲所生小孩至周岁时人巨细胞病毒感染率达85.1%，怀孕早期感染人巨细胞病毒的婴儿约15%～20%将终生残疾[24]。因此对此类病毒原发感染的临床评估极其重要。李牧等[25]对中晚期孕妇行弓形体IgG抗体亲和力检测，并对胎儿或新生儿脐血进行弓形体IgM检测，发现原发性宫内感染率(53.45%)明显高于继发性宫内感染率(22.73%)；活动性宫内感染率(45.00%)高于非活动性宫内感染率(11.43%)。在孕妇巨细胞病毒感染研究中[26]，低亲和力抗体者在不良孕产史孕妇中所占比例高于初次妊娠孕妇，提示不良孕产史孕妇的胎儿感染巨细胞病毒风险率高于初次妊娠孕妇组。抗体亲和力试验可高效诊断相关病原体宫内感染，有利于产前诊断和优生优育，且具有较高的临床价值。

3.3 免疫状态分析 尽管人群普遍接种风疹、麻疹和腮腺炎等疫苗，其相关的传染病发病率得到了有效控制，但仍有少数病例发生。当疑似病例出现时，我们不仅需要确认是否由相关病原体引起，还要知道是否经免疫接种，或者免疫接种未成功，或免疫接种成功过但免疫力消失。抗体亲和力技术已被用于免疫接种效果评价和免疫状态区分。Souza等[27]在麻疹免疫效果研究中发现，初次免疫后2～8周抗体以低亲和力形式存在，且随着时间增长，亲和力增加；在90份已接种两剂疫苗的血标本和42份儿童脐血标本中未检出低亲和力抗体，证明抗体亲和力技术是评价免疫效果较好的工具。Pannuti等[28]以107名无麻疹疫苗免疫史和52名有麻疹疫苗免疫史的患者为研究对象，发现97.2%无免疫史的患者呈麻疹抗体低亲和力结果，即初次免疫反应；48.1%有免疫史患者未检出IgG抗体或检出低亲和力抗体，即为免疫未成功的原发免疫失败，51.9%有免疫史患者检出高亲和力抗体，即为免疫力消失的继发免疫失败。抗体亲和力试验可鉴别受种者的疫苗免疫状态，特别是对那些计划免疫工作薄弱地区或免疫史不明的人群的监测有较大意义。应用抗体亲和力可指示免疫保护力下降的特点，可判断人群是否需要再接种以及何时再接种。

4 商品化试剂盒的应用

在优生优育检测中，已有抗体亲和力检测的商品化试剂盒。有学者[29]对意大利索灵公司和美国罗氏公司的巨细胞病毒亲和力检测试剂盒进行评估发现：二者的相对灵敏度为90.90%，相对特异度为98.25%，相对符合率为98.02%，两种试剂盒的检测效果满意，临床上应用前景较好。目前，仍有许多学者及机构在研制抗体亲和力的检测试剂盒。

抗体亲和力试验是判断传染病原发感染和非原发感染的最好方法之一，是对传统病原学及免疫学检测技术的重要补充。近年来，对该实验技术的不断摸索及持续改进，使得其灵敏度和特异度均有所提高，方法更易于应用。笔者相信今后会有越来越多的病原体抗体亲和力检测试剂盒推向市场。

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蓝翊文(1969～)，女，研究生，主管技师，研究方向：病原微生物检测。

R 446.6

A

0253-4304(2016)12-1744-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.32

2016-07-30

2016-10-18)