基层医院嗜血杆菌检测方法及耐药性的研究应用

梁建芬 综述,吴开进 审校

(1.贵港市第二人民医院检验科,广西贵港 537132；2.玉林市红十字医院检验科，广西玉林 537000)

·综 述·

基层医院嗜血杆菌检测方法及耐药性的研究应用

梁建芬1综述,吴开进2审校

(1.贵港市第二人民医院检验科,广西贵港 537132；2.玉林市红十字医院检验科，广西玉林 537000)

嗜血杆菌; 分离鉴定; 生物型; 抗菌药物耐药性

嗜血杆菌引起人类机会性感染致病越来越受到临床关注，主要有流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae，HI)和副流感嗜血杆菌(hemophilus parainfluenzae，HPI)，国内对嗜血杆菌研究也有60年历史。嗜血杆菌初次培养对营养要求高，在血平板上不生长或易被革兰阳性球菌抑制，不易培养。在基层医院由于缺乏可培养菌的分离培养条件，如专用培养基、CO2环境、人员业务水平所限而不能辨别菌落等因素影响，实验室往往忽略嗜血杆菌分离而导致其检出率极低，对其致病性、分布、分型及耐药研究应用较少，本文就此作简单的综述。

1 嗜血杆菌检测分离培养

1.1 直接涂片染色镜检 革兰染色镜检对具有特殊形态的病原微生物检查是一种快速有效的方法，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。对呼吸道原始标本进行革兰染色，如镜检见短小呈丝状体或线状体阴性杆菌可初步怀疑为嗜血杆菌。由于嗜血杆菌本身就存在多形态特点，呈高度的异质性，抗菌药物使用也会引起细菌变异，镜检出典型嗜血杆菌形态的几率逐渐下降，因此，涂片检查嗜血杆菌存在局限性。

1.2 选择培养基分离 传统使用普通巧克力平板分离嗜血杆菌的结果往往不太理想，许多改良的巧克力琼脂培养基有效提高嗜血杆菌的分离率[1-2]。除了巧克力培养基外，国内已研制出不含巧克力的嗜血杆菌专用培养基(温州市康泰生物科技有限公司生产)，更容易分辨嗜血杆菌生长菌落形态。基层医院可根据成本核算情况购买成品，避免自制巧克力培养基质量难控问题，而市售巧克力平板的质量良莠不一，使用前需用标准菌株进行质量评价。选择好培养平板后，将标本同时接种在血平板、嗜血杆菌培养基上，严格三区划线，接种以保证长出单个菌落，置5%～10%CO2环境中(无CO2箱也可用稍大的烛缸代替)35 ℃培养24～48 h[3]。

1.3 鉴定 嗜血杆菌在血平板上不生长,巧克力平板上生长为无色或灰白色，圆形、透明、光滑、湿润的菌落，革兰染色为阴性短小杆菌。“卫星现象”可鉴别HI和HPI，在血平板上HI和HPI的“卫星现象”都能出现，用X因子和V因子纸片在M-H平板上，仅有HPI出现“卫星现象”。Barbe等[4]用API-NH鉴定条能准确鉴定绝大部分临床分离的HI，API-NH鉴定试条是成熟的商品化试剂盒，因操作简便而广泛应用于临床实验室。API-NH不仅能快速鉴定细菌并可对嗜血杆菌进行生物分型，能够满足基层实验室的要求。

2 嗜血杆菌分布

研究嗜血杆菌的分布，主要是了解嗜血杆菌的流行情况，为预防控制和治疗感染提供临床资料。嗜血杆菌的分布因研究对象和方法不同，结论不尽一致。陈东科等[5]研究发现嗜血杆菌分布与性别无关，而与寄生部位有关。张玉妥等[6]对健康人群中HI带菌情况调查发现，不同年龄群口咽部HI带菌率具有明显差异，学龄前儿童、学龄儿童、成人HI检出率分别为39.8%、20.7%、7.0%，年龄越小带菌率越高，高带菌率人群会成为HI感染的高危人群。王冬国等[7]调查儿科住院患者嗜血杆菌分布结果，年龄在4月至2岁的患儿有2/3以上能够检出HI或HPI，并且HPI的检出率也逐步升高，带菌率表明儿科住院患者必须切实控制呼吸道感染的传播。吴开进等[8]报道318例重症手足口病儿童细菌分离状况，其中嗜血杆菌的分离率为20.1%。目前基层医院对嗜血杆菌分布的研究资料不多，因此，有必要积极开展相关研究工作，有利于基层医院对嗜血杆菌感染的预防控制和治疗提供制定策略依据。

3 嗜血杆菌分型

正确的分型是嗜血杆菌致病性和流行调查研究基础，通常有以下几种方法:血清学分型，生物分型法，外膜蛋白分型，基因分型等。血清学分型的特点为快速简便,其局限性在于荚膜多糖抗原抗原性较弱,较难制备高特异性的抗血清，不易推广；外膜蛋白分型，基因分型等分型方法虽然有较好的前景，但受限于常规实验室条件，目前基层医院仍难以普及。生物分型方法简单，并且试剂商品化，是一种比较经典的方法，根据嗜血杆菌对吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶3个生化反应不同，嗜血杆菌被分为生物型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ8个型。1982年Holmes等[9]用API 20E可以对HI进行生物分型。Landgraf等[10]在对1 015份脑脊液分离的HI进行生物学分型研究中，Ⅰ型占70.9%，Ⅱ型占27.5%。赖国祥等[11]报道儿童感染组和健康组咽拭子分离的鼻咽部HI学龄前组生物分型均以Ⅵ型(分别为37.5%和61.1%)占优势,学龄组则均以Ⅰ型(分别为25.0%和41.2%)占优势,与解静平等[12]报道的肺炎患儿分离株和健康儿童咽拭子培养株均以Ⅱ型为主(分别占49%和45%)不同。有研究资料表明，儿童携带的HI有致病的倾向，致病菌株以HI血清b型为主，生物学分型和血清型与HI疾病有一定的关系[13-15]。基层医院采用简易的生物分型方法是值得推广。

4 嗜血杆菌耐药性

嗜血杆菌耐药性在国外研究得比较早，1972年欧洲首次发现HI对氨苄西林耐药之后，在世界各地相继被报告，并有逐年上升趋势，Kohno等[16]对HI作一项全球性抗菌药物耐药监测调查，结果显示HI耐药率在不同国家差别较大，最低意大利为1.8%，韩国为64.7%。国内研究和报道最多的也是HI对氨苄西林耐药性,2002年杨永弘等[17]监测HI对氨苄西林的平均耐药率为9.6%(4.8%～14.4%)，2010年Mohnarin报告HI对氨苄西林的耐药率上升至45.0%[18]。HI对氨苄西林耐药率在感染患者年龄也有差异，CHINET 2010年监测显示儿童分离的HI对氨苄西林的耐药率为35.1%[19]。HI对氨苄西林的耐药机制，除了细菌产生β-内酰胺酶所致外，部份β-内酰胺酶阴性流感嗜血杆菌株也出现对氨苄西林耐药状况，主要是菌株细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白发生改变，引起青霉素结合蛋白与靶位亲和力降低，其次是外膜蛋白改变导致耐药[20]，这些新耐药机制出现给临床选择抗菌素带来挑战。

HI对四环素、复方磺胺甲恶唑的耐药率较高，有资料表明HI对这两种抗菌素的耐药是HI基因突变所致[20]。CHINET 2010年监测HI对头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟耐药率分别为2.3%、20.8%、15.2%[19]。随着广谱抗菌药物的广泛应用，HPI耐药率也不断增加。有报道HPI对氨苄西林为42.5%～65.2%[18，21]，HPI对氨苄西林的耐药性主要与产生β-内酰胺酶有关，其机制由质粒介导，部分为质粒接合子，并携带完整的TnA型转座子及其他耐药基因；国内报道从儿童分离的HPI产酶率差异也大，最高报道为37.8%[22]，产酶株的增加也是导致HPI出现多重耐药性的重要因素。

5 结束语

随着微生物检验技术快速的发展，一些半自动或全自动的微生物鉴定仪器和药敏分析系统在基层医院得到应用，使微生物检测变得简易、快捷。因此，除了完成常见的简单的鉴定药敏报告外，基层医院加强苛养菌的培养及其耐药性监测研究是细菌学常规检验一种要求。

[1]陈东科,胡云建,张秀珍.嗜血杆菌分离培养基的评价与应用[J].中华检验医学杂志,2001,24(1):28-30.

[2]谭萍,张松,赖秀花.改良流感嗜血杆菌培养基的研究[J].实用预防医学,2003,10(2):150-151.

[3]叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M].3版．南京:东南大学出版社,2006:836-837.

[4]Barbe G,Bsbolat M,Bpeufgras JM,et al.Evaluation of API-NH,a new 2-hour system for identification of Neisseria and Haemophilus species and Moraxella catarrhalis in a routine clinical laboratory J[J].Clin Microbiol,1994,32(1):187-189.

[5]陈东科，胡金树，许宏涛，等.嗜血杆菌在儿童上呼吸道中的分布差异及耐药趋势分析[J].中华流行病学杂志，2007，28(10)：1044.

[6]张玉妥，张艳芳，季建军，等.健康人群中流感嗜血杆菌带菌情况调查[J].中国公共卫生，2000，16(8)：723-724.

[7]王冬国，李莹，赵琪，等.儿科住院患者流感、副流感嗜血杆菌的检测与药物敏感试验[J].中国微生态学杂志，2006，18(4)：302-303.

[8]吴开进，林世恒，许斌，等.318例重症手足口病患儿咽拭子病原菌培养结果及药敏分析[J].中华医院感染学杂志，2013，23(1)：228-231.

[9]Holmes,RL,DeFranco LM.Otto M.et al.Novelmethod of biotypeing Haemophilus influenza THAT USES api 20E[J].J Clin Micorbiol,1982,15(11):1150-1152.

[10]Landgraf IM，Vieira M.Biotypes and Serotypes of Haemophilus influenza from patients with meningitis in the city of SaoPauLo Brazil J[J].Clin Microbiol,1993,31(3)：743-745.

[11]赖国祥,叶礼燕,李玉德,等.儿童下呼吸道流感嗜血杆菌感染的临床调查[J].中华儿科杂志,1997,35(11):590-592.

[12]解静平,薛冰,王丽红,等.儿童流感嗜血杆菌血清型及生物分型研究[J].临床儿科杂志,1997,15(4):238-239.

[13]张鸿文，叶礼燕，陈新民，等.健康学龄前儿童咽部流感嗜血杆菌血清分型及其与季节关系的研究[J]．中国实用儿科杂志，2002，17(3):164-165.

[14]华春珍，孙莉颖，李建平，等.杭州某幼儿园作健康儿童流感嗜血杆菌携带状况及其血清分型[J].中华检验医学杂志，2005，28(4)：398-400.

[15]陈辉,盂晓军,俞慕华,等，深圳市学龄前儿童流感嗜血杆菌带菌情况及分型研究[J].中国实用医药杂志，2009,27(4):82-84.

[16]Kohno S,Hoban D.Comparative in vitro activity of telithromycin β- lactamase antimicrobial against bacterial pathogeos from community-acquried respiratory tract infection:data from the first year of PROTEKT(1999-2000)[J].J Chemother,2003,15:335-341.

[17]杨永弘，陆权，邓力，等.四地儿童肺炎链球菌、流感嗜血杆菌抗菌药物敏感性检测(2000～2001年)[J].中华儿科杂志，2002，40(4)：461-466.

[18]吕嫒，马序竹，崔兰卿.2010年度卫生部全国细菌耐药监测报告:流感嗜血菌与副流感嗜血菌报告[J].中华医院感染学杂志，2011，21(24)：5144-5146.

[19]张泓,孔菁,王传清,等.2010中国CHINET流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2012,12(3):180-184.

[20]钱夏婧，华春珍，景伟兴，等.流感嗜血杆菌耐药模式监测及耐药机制研究[J].中华检验医学杂志，2011，34：262-264．

[21]李云.45株副流感嗜血杆菌感染及耐药性调查[J].国际检验医学杂志,2010,31(1):29-30.

[22]田爱丽,于爱民.儿童上呼吸道感染副流感嗜血杆菌的鉴定及耐药性分析[J].中国医药导报,2010,7(1):71-73.

梁建芬，女，主管检验师，主要从事微生物检验研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.030

A 文章编号：1673-4130(2016)07-0946-03

2015-10-11)