丙型肝炎病毒F蛋白缺失对病毒复制、致病及感染的影响分析

刘亚 明全

(1.宜昌市第三人民医院医保办；2.宜昌市第三人民医院肝病科，湖北 宜昌 443000)



丙型肝炎病毒F蛋白缺失对病毒复制、致病及感染的影响分析

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(1.宜昌市第三人民医院医保办；2.宜昌市第三人民医院肝病科，湖北 宜昌 443000)

目的 观察丙型肝炎病毒F蛋白缺失对病毒复制、致病及感染的影响。方法 按生物化学的方法进行，制备丙型肝炎病毒的RNA的转录体；根据培养的结果进行相关的检测实验，对相关的实验结果进行整理、记录和分析。结果 引入突变基因的表达数与原基因表达数没有显著的差异且两组核心蛋白的表达水平无显著差异；F蛋白的表达在肿瘤组织中要高于其他组织，表明在肝癌的形成与F蛋白有一定的相关性；含有单一突变的核心蛋白与野生型的核心蛋白在结构方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二级结构有了较多的变化。结论 HCVF蛋白的缺失对病毒的翻译和复制的过程没有影响，对病毒的翻译、复制和治病性的影响加大的是核心蛋白的二级结构。

丙型肝炎病毒； 核心蛋白； 病毒复制； F蛋白

丙型肝炎病毒的感染是导致慢性肝脏疾病的罪魁祸首，由此导致的感染可进一步发展成为肝硬化、脂肪肝和肝癌等重疾[1]。为进一步了解丙型肝炎病毒F蛋白是如何影响病毒的感染、致病和复制的过程的，本研究观察了在F蛋白缺失的情况下病毒翻译和复制的过程，并对其缺失后核心蛋白的二级结构是如何变化的做进一步的分析

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 QuikChang LinghrningSite-Directed Mutagenesis Kit [Stratagene公司(美国)];异丙基硫代半乳糖苷、5-溴4-氯3-吲哚-β-D半乳糖苷、NZ胺、酵母提取物；14 mL BD Falcon 聚丙烯管(上海雅怡科学实验设备有限公司)；HCV NS5A 单克隆抗体(Charles M .Rice教授)，T7体外转录试剂盒M-MLV反转录酶(Promrga 公司)；胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、Alex488羊抗鼠荧光、FITC-羊抗人IgG、Lipofectamine 2000、RNA抽提试剂(美国invitorgen公司)。

1.2 细胞株和质粒构建 以试剂盒的说明进行定点突变引入试剂盒，以PFL-J6JFH1作为模版，引入突变的数量为5处，引入这些突变的目的在于终止已知的所有的F蛋白的复制，而这一过程并不改变HCV氨基酸的基因序列。

1.3 病毒RNA转录体制备 (1)线性化处理：通过XbaⅠ将质粒进行线性化的处理；(2)体外的转录：通过T7转录试剂盒进行；(3)纯度和完整性检测：试剂选择体积比为25:1:24的苯酚、异戊醇和氯仿的混合液，然后用1.5%的琼脂糖凝胶通过电泳对其纯度和完整性进行检测。

1.4 RNA转录体转染和细胞培养 RNA的转录体的转染：选用1 000 g的胰酶消化细胞，依次经过离心、分离、洗涤、重悬、稀释、混匀和电击(270 V、100 mΩ)等过程然后转入恒湿恒温箱(5%CO2、37 ℃)培养。细胞的培养：Huh7.5.1细胞在10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置于5%CO2,37 ℃饱和湿度的培养箱培养，培养液中添加L-谷氨酰胺 2 mmol/mL，NEAA 0.1 mmol/L，链霉素 100 g/mL及青霉素100 U/m。

1.5 对PCR进行定量 将特异性引物引入HCV5`的非编码区，进行转染，72 h后对转染细胞的总RNA或者是其上清RNA进行抽提，定量检测细胞中的HCVRNA；对转染细胞HCV RNA的浓度进行计算。

1.6 荧光观察 将进行了转染的细胞进行培养，首先接种到细胞培养板上(96孔细胞培养板)，然后放入培养箱(37℃、5% CO2)进行培养，培养完成后(约48 h)弃去上清液；向每孔加入约100 μL的甲醇，在-20 ℃放的环境中静置约20 min；进行PBS洗涤，每次5 min，共3次；然后每孔中依次加入Triton X-100(100 μL，0.1%)、BSA、HCV患者血清(1∶100)、FITC-羊抗人(1∶100)或Alex488羊抗鼠荧光(1∶100)，然后进行避光哺育(1 h)，最后有荧光显微镜进行检查并拍照。

1.7 病毒滴度检测 对不同时间的转然后的细胞上清液进行收集，取3 000 g左右进行离心分离，以达到去除其中细胞碎片的目的，之后与-80 ℃的环境进行保存。放入培养箱继续培养，最后进行病毒滴度的检测。

1.8 统计学方法 对研究的数据进行整理和校对，计量资料和技术资料的比较分别采用t检验和χ2检验，数据的整理和统计学分析分别选择EXEL和SPSS16.0，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 引入突变基因与原基因表达数的比较分析 引入突变基因的表达数与原基因表达数差异无统计学意义，且两组核心蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 F蛋白缺失对病毒致病性的影响 F蛋白的表达在肿瘤组织中要高于其他组织，表明在肝癌的形成与F蛋白有一定的相关性。

2.3 RNA的二级结构对病毒翻译、复制过程及致病性的影响 含有单一突变的核心蛋白与野生型的核心蛋白在结构方面基本保持一致；F缺失型核心蛋白的二级结构有了较多的变化。

3 讨 论

F蛋白是由HCV的核心的编码序列经过移码编码产生的，一般认为编码核心蛋白与编码F蛋白的序列是相互重叠的。基因的内部翻译的起始位点被认为是密码子26[2-3]。Core+1/S蛋白(最短的F蛋白)的编码区位是核心蛋白编码区(85～87)的一段基因， 该区域被认为是F蛋白的进行内部翻译的起始位点[4]。目前为止，发现的移码蛋白已有多种，但是对其生物功能的认识还是十分的不清晰[5-6]。为了更深入的了解F蛋白的生物功能，明确其是如何影响HCV的复制、翻译和致病过程的，该研究对野生型J6JFH1和自我构建的突变体(J6JFH1/△F)进行了对比和分析。结果显示突变体HCV的RNA的蛋白质的表达水平与之前相比降低了很多，与此同时，病毒的RNA的水平也下降明显(下降近95%)，上清液中的病毒颗粒的数量也明显减少[7]。将自我制备的突变体的RNA转染到Huh7.5.1细胞上，对细胞内病毒蛋白的表达性进行检测，对上清病毒RNA和病毒的滴度进行检测，结果表明，野生型和突变体之间无明显差异[8]。由于引入突变可能引起HCV核心基因的二级结构的改变，而核心基因的二级结构能够对HCV RNA的复制和翻译的过程造成影响；进一步对核心基因的二级结构进行分析，结果表明，病毒的翻译和复制的过程受到核心基因二级结构变化的影响，具体的过程有待进一步的研究。

[1] 韩昵薇，何应中，邹焰，等. 丙型肝炎病毒RNA定量检测的诊断评价[J]. 贵州医药,2013,37(09):829-831.

[2] 徐孝东,鲁卫东,岳明,等. 丙型肝炎病毒感染者F基因区变异临床意义的初步研究[J]. 中华疾病控制杂志,2014,18(4):322-325.

[3] Sericea SS，Kevin RK，Tara MB.Long-term follow-up for incident cirrhosis among pediatric cancer survivors with hepatitis C virus infection[J].Journal of Clinical Virology, 2015,71:18-21.

[4] 孙瑞娜,张艳妮,汪俊,等. 女贞子抗丙型肝炎病毒复制酶活性成分研究[J]. 药学学报,2013,48(09):1390-1396.

[5] 朱丹燕,鲁卫东,邓小昭,等. 丙型肝炎病毒F蛋白上调人外周血单个核细胞IL-13的表达[J]. 中华疾病控制杂志,2015,19(2):115-118+126.

[6] 赫晓林,黄建炜,许瑞安,崔秀灵. HBV病毒复制机制及慢性乙型肝炎药物靶点[J]. 中国药理学通报,2015,31(2):152-156.

[7] 齐月,金清龙,温晓玉,牛俊奇. 丙型肝炎病毒JFH1在不同三维培养体系中复制水平的比较[J]. 吉林大学学报：医学版,2012,38(1):19-22+175.

[8] 王鑫,高香翠,时雯雯,等.慢性丙型肝炎的个体化抗病毒治疗进展[J]. 广东医学,2012,33(10):1516-1518.

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