三氧化二砷治疗肝癌的出路—联合用药

彭贵主，叶啟发，2，王垒

（1.武汉大学中南医院 武汉大学肝胆疾病研究院/武汉大学移植中心/移植医学技术湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071；2.中南大学湘雅三医院 卫生部移植医学工程技术研究中心，湖南 长沙 410013）

·专家笔谈·

三氧化二砷治疗肝癌的出路—联合用药

彭贵主1，叶啟发1，2，王垒1

（1.武汉大学中南医院 武汉大学肝胆疾病研究院/武汉大学移植中心/移植医学技术湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071；2.中南大学湘雅三医院 卫生部移植医学工程技术研究中心，湖南 长沙 410013）

三氧化二砷；肝癌；中药；免疫调节

三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）又名“砒霜”或“鹤顶红”，为是一种广为人知的剧毒药。但是，在中国传统医药学中，ATO有着悠久用药的历史。早在2400年前，ATO就被用来治疗各种顽疾如溃疡、瘟疫、疟疾等[1]。20世纪70年代，中国学者采用现代科学的给药方式，创造性地将ATO应用于血液系统恶性肿瘤，取得了令人瞩目的成就。如今，ATO已成为难治性或复发性急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的经典用药[2]。近年来，人们研究ATO抗癌的热情被重新点燃：一方面，ATO相继被引入胆管癌[3]、结肠癌[4]、鼻咽癌[5]以及多发性骨髓瘤[6]、横纹肌肉瘤[7]等多种实体肿瘤的治疗，同样取得快卓越的疗效；另一方面，ATO结合现代给药技术与用药方式，联合其他治疗手段，极大开阔了人们关于ATO抗癌研究的思路和视野，并极大提高了ATO抗肿瘤的疗效并减少了毒副作用。

我国是一个肝癌大国[8]，肝脏是ATO甲基化代谢的主要场所[9]，因此ATO治疗肝癌前景广阔。前期工作中我们发现ATO可以作为一种免疫调节剂包括降低肿瘤局部浸润调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）和提高肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrated lymphocytes，TILs），进而在肝癌的治疗中发挥免疫调节作用。但是，ATO单独用药治疗肝癌疗效有限，且ATO本身的致癌性及毒性也不容忽视。本文着重分析ATO治疗肝癌的局限与对策，从小剂量应用ATO作为免疫佐剂，联合其他药物或治疗手段治疗肝癌这一ATO治疗肝癌的新方向进行总结和展望。

1 ATO单独用药治疗肝癌

肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，致死率高，预后差。传统的化疗药物如他莫昔芬、氯他胺等，治疗效果和预后差强人意。肝脏是ATO甲基化代谢的主要场所，因此ATO靶向肝癌抗肿瘤的作用更强。体外研究发现ATO选择性阻断肝癌细胞的生长而不影响正常肝细胞[10]，体内尾静脉给药ATO选择性积聚于小鼠皮下移植瘤内而非脑、肝、肾等正常组织[11]。

药动学研究发现，ATO在体内符合二室效应（twocompartment model），其在体内分布快，血浆清除半衰期短[12]。动物模型研究发现，与5-Fu相比，ATO不会引起肝癌小鼠恶液质的加重[13]。临床研究发现ATO治疗引起的毒性反应是轻微的、一过性的，不会引起严重的骨髓抑制和二级伤害。并且，ATO也不会带来远期的毒性反应[2]。

研究发现，ATO主要通过活性氧和氧化应激诱导肝癌细胞的凋亡而非病理性死亡，表现为活性氧（reactive oxygen species，ROS）的募集[14]、转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白[15]及Bim（Bcl-2111）的上调[16]、谷胱甘肽（GSH）[17]及GCS-γ[15]的下调，并呈浓度与时间依赖效应。ATO通过上调PTEN，使细胞停滞于G2/M期，阻断肝癌细胞的增殖[18]。ATO还能直接引起肝癌细胞DNA的损伤，或者通过DNA-甲基化诱导micro RNA-491生成阻断TGF-β/SMAD3/NF-κB信号途径阻断血管因子的形成、抑制肝癌细胞的生长[19]。另外，ATO抗肝癌的机制还可能与线粒体途径的Cas-pase-3的活化及磷脂酰丝氨酸外部化等有关[17]。

但是，研究发现ATO并非对所有的肝癌细胞敏感。与Hep-J5细胞相比，ATO对肝癌细胞SK-Hep-1更加敏感，因为其缺乏低氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）和葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78kda，GRP78）[20]。

1.1ATO控制肝癌的扩散和转移

转移和复发是目前肝癌治疗最大的瓶颈。研究发现，ATO可能通过多种途径抑制肝癌的扩散和转移。其机制可能为：（1）ATO能诱导肝癌细胞神经酰胺的生成，通过下调基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）阻断肝癌细胞的侵袭[21]；（2）ATO通过下调肝癌细胞CD147和MMP-2的表达抑制肝癌细胞的侵袭和转移[22]；（3）ATO可能通过DNA甲基化上调microRNA-491，一方面降低MMP-9的表达，另一方面阻断NF-κB的活化，阻断肝癌细胞的侵袭和转移[23]；（4）ATO可能通过抑制Twist的活化阻断肝癌细胞EMT，抑制肝癌的进展和转移[24]，这一点在肝癌肺转移动物模型[25]及临床[24]均得到证实。

1.2ATO与肝癌肿瘤干细胞

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）在肿瘤术后的复发和转移中扮演关键角色[26]，并且当前的化疗药物对CSCs无效[27-28]。ATO不仅能增强肝癌CSCs对传统化疗药物的敏感性，还能直接下调肝癌CSCs表面CD133及其他干性基因的表达进而阻断CSCs的自我更新并介导CSCs的去分化[29-30]。进一步研究发现，这可能与DNA甲基化诱导的microRNA-49下调SMAD信号有关[31]。体内研究证实肝癌局部切除术术后，ATO能显著降低肝癌小鼠肝癌的复发率[29]。

2 ATO联合用药治疗肝癌

研究发现ATO只对早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）蛋白表达阴性的肝癌患者有效。因为，虽然PML蛋白与肝癌患者预后呈正相关，但是PML高表达也会通过下调乙醛脱氢酶家族3成员A1（aldehyde dehydrogenase 3A1，ALDH3A1）破坏ATO的抗肿瘤活性[32]。另外，与体外实验与动物实验的结果的相反，I I期临床试验发现单独的ATO治疗肝癌的作用有限[33-34]。一方面ATO抵抗的肝癌细胞高度表达p糖蛋白（p-glycoprotein，p-gp），而高度表达的p-gp会通过多种机制降低ATO的胞内浓度[33]；另一方面，ATO抵抗的HCC细胞高度表达多重耐药基因2（MDM2），MDM2会导致p53或p73的失活，最终阻断ATO介导的细胞凋亡[35]。

ATO在实体肿瘤的应用受到很大的限制，原因有三：（1）ATO取得实体肿瘤效应的剂量远大于血液系统恶性肿瘤[36]；（2）高剂量的ATO会引起肝、心、肾毒性，甚至猝死[37]；（3）剂量依赖性的毒性导致的内在性抗药的产生是ATO治疗肝癌失败的主要原因，也是ATO遗传毒性产生的主要原因[38]。联合用药的目的在于，通过药物的协同效应达到减毒增效的目的。目前，ATO联合其他药物达到减毒增效或减毒不减效是当前ATO抗肝癌研究的热点。

2.1ATO联合靶向药物

分子靶向治疗（molecular targeted therapy，MTT）是肿瘤治疗领域发展的新方向。相比传统的治疗手段，MTT具有更好的分子靶向性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。近年来，ATO联合靶向药物在肝癌治疗领域取得了显著的进展。

2.1.1ATO协同增强靶向药物的细胞毒性：索拉菲尼是唯一被美国FDA批准的用于肝癌的靶向药物[39]，但是从临床应用的效果来看，索拉菲尼仅对部分患者有效[40-42]。研究发现ATO可以通过降低MAPK或者Akt的活性协同索拉菲尼阻断HCC的增殖或促进HCC的凋亡[43]，其机制可能是通过阻断Akt-GSK-3βmTOR-S6K-4EBP信号通路增强索拉菲尼的抗肝癌特性[44]。另外，ATO还可以通过调控胸苷合酶的水平选择性提高5-Fu对肝癌细胞的细胞毒性，而非肝星状细胞的细胞毒性[43]。

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA），又称视黄酸、维生素甲酸、维甲酸等，是动物体内维生素A的代谢中间产物，有着广泛的生理学和药理学活性。与ATO一样，ATRA也能抑制肝癌细胞的体外增殖、诱导肝癌细胞的凋亡，并且具有时间与浓度依赖效应。研究发现，ATRA可能通过提高胞内自由钙浓度协同ATO降低各自用药浓度[45]。

水通道蛋白（aquaporin，AQP）又叫水孔蛋白，它是存在于细胞膜上快速转运水的特异性孔道。原位杂交实验显示，AQP9在肝细胞表达较强，主要分布在肝细胞的基膜面和血窦面，而在胆小管的质膜上无表达。研究发现调节AQP9的表达可以影响肝癌细胞的生物学行为，并影响ATO对肝癌细胞的敏感性[46]。

3-叠氮-3-脱氧胸苷（Azidothymidine，AZT），在细胞内通过转化为二磷酸酯和三磷酸酯的衍生物抑制病毒逆转录酶达到抗病毒的目的，主要用于治疗艾滋病获得性免疫缺陷综合症。研究发现ATO联合AZT后，其IC50值明显降低。研究认为AZT可能通过抑制端粒酶活性、激活caspase-3途径来增强ATO抑制肝癌细胞的增殖[47]。

聚肌苷酸聚胞苷酸（Poly I:C）作为一种双链RNA（dsRNA）的类似物，常作为佐剂诱导肿瘤细胞的凋亡。研究发现，Poly I:C不仅能通过Toll样受体3（toll-like receptor 3，TLR-3）途径增加ROS的生成、诱导线粒体功能障碍促进肝癌细胞的凋亡，还能引起caspase3/8/9的活化、Bcl-2和生存素的下调以及Bax和Bia的上调协同增强ATO抑制肿瘤细胞的生长[48]。

2.1.2ATO联合靶向药物降低其毒性反应：聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]，存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，在DNA损伤修复和维持基因组稳定性方面发挥重要作用。其中，PARP-1是PARP家族的主要成员，可被DNA损伤激活，随后招募DNA修复蛋白启动DNA修复。PARP-1阻断剂可通过阻断DNA损伤修复提高多种抗肿瘤药物的疗效。4-氨基-1，8-二萘甲酰胺（4-amino-1，8-naphthalimide，4-AN）是PARP-1经典的阻断剂，可以通过上调cyclingB1的表达阻断ATO介导的G2/M检查点的激活，降低高剂量ATO引起的细胞毒性的产生[49]。

另一方面，ATO抗肝癌的同时，还通过激活NF-κB及其下游的抗凋亡、促炎因子的产生诱导肝癌细胞的耐药性及遗传毒性的产生，并且这种效应呈PARP-1依赖性。PARP-1另一阻断剂，N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）是一种潜在的抗氧化剂，其中间产物L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽（GSH）的必须氨基酸。GSH是细胞内最重要的保护剂，可防止细胞免受体内外的ROS和各种细胞毒素物质的损害。研究发现NAC可以通过阻断ATO介导的PARP-1和NF-κB途径降低氧自由基的产生，减轻ATO引起的氧化损伤[50]。

2.1.3ATO联合靶向药物打破ATO抵抗：Nultin-3作为MDM2的拮抗剂，研究发现单独的ATO或者Nultin-3对ATO-抵抗的肝癌细胞不敏感，只有联合用药才能取得显著的抗肿瘤效果[35]。其机制可能是Nultin-3作为MDM2的拮抗剂，不仅通过阻断p-gp增加ATO胞内浓度，还能阻断p-73、p53的MDM2突变来降低肝癌细胞对ATO的药物抵抗。

TG相互作用因子（TG-interacting factor，TGIF）是一种转录共抑制因子，其基因位于18号染色体短臂上，其蛋白属于三氨基酸环伸展蛋白（three amino acid loopextension，TLAE）家族的同源域包含蛋白。ATO一方面可以通过TGF-β/Smad信号通路引起下游p21活化诱导肝癌细胞的凋亡，另一方面还能通过TGIF的上调对抗自身的抗肿瘤效应。研究发现通过EGFR/PI3K/Akt途径下调的TGIF可以通过干扰TGF-β信号让肝癌细胞对ATO更加敏感[51]。

临床研究发现ATO只对PML阴性的肝癌患者有效，这可能与ROS的生成与募集障碍有关[52]。研究发现HCC患者肿瘤组织中高度表达PML，ALDH3A1信号阻断剂可以解除PML的抗ATO效应，这可能有助于ATO对PML阳性肝癌患者的临床应用[32]。

2.2ATO联合中药

传统中医药中具有“补气、补肝肾、活血补血”功效的药物及方剂有极为显著的抗氧化效果，还具有一定的免疫调节作用和抗肿瘤效应。近年来，ATO联合中药成为肝癌治疗领域的研究热点。

2.2.1ATO联合氧化剂型中药增强抗肿瘤效果：ATO的细胞毒性是氧化剂敏感型，研究发现，白藜芦醇（resveratro）[53]、淫羊藿苷（icariin）[54]、冬凌草素（oridon）[55]、金雀异黄素（genistein）[56-57]等，作为潜在的氧化剂，可以协同ATO通过阻断NF-κB的活性增强活性氧的生成促进肝癌细胞的凋亡。其机制可能为：（1）下调Akt和XIAP信号通路；（2）降低线粒体膜电位（△φm）；（3）下调Bcl-2、上调Bax；（4）增强caspase-3/9信号；（5）促进细胞色素C的释放；（6）抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的表达。

2.2.2ATO联合其他抗肿瘤中药协同抗肝癌：华蟾素（cinobufacini）和ATO均能抑制肝癌移植瘤VEGF、EG-FR的表达，并可降低MVD。研究发现，不管是瘤重和瘤体来讲两药相互作用系数（coefficient of drug interaction，CDI）均小于1，表明两药协同抑瘤作用。并且，联合用药并未增加裸鼠肝、肾和造血系统的毒性[58]。

2.2.3ATO联合其他中药降低毒副作用：ATO还可以联合其他中医药达到减毒不减效的作用。隐丹参酮（cryptotanshinone），是一种从丹参酮中提取的具有抗菌、抗炎、降温作用的单体。研究发现隐丹参酮可以改善ATO引起的血液系统副作用，并且联合用药并没有影响ATO的抗肿瘤作用，其具体机制仍待进一步研究[59]。

3 ATO联合局部治疗

局部治疗（local regional therapy，LRT）是不可切除肝癌重要的治疗手段，包括射频消融（radiofrequency ablation，RFA）及肝动脉栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）等。

3.1ATO联合RFA

RFA是在超声或CT引导下将射频电极插入肿瘤组织，射频电极发出400 kHz的频率波，通过高速运动震荡产生摩擦热使得肿瘤组织内部升温，细胞发生固缩、坏死，从而杀灭肿瘤细胞达到治疗目的。临床研究发现RFA只对直径＜3 cm的肿瘤有效（80％～90％），而对直径＞3 cm的肿瘤作用有限（50％～75％），其原因可能是灌注介导的组织冷却和热库效应。并且，射频消融在杀死癌变组织的同时，也会损伤周围正常组织。研究发现ATO一方面能诱导肿瘤血管的管壁，有高热疗法的潜能[4]；另一方面，ATO还能阻断线粒体呼吸链增加肿瘤细胞内P02，增强肝癌细胞对RFA的敏感性[60]。临床研究证实，ATO联合RF能协同治疗大直径的肿瘤[61]。

3.2ATO联合TACE

TACE，是不能切除的HCC的一种重要的局部治疗手段[62]，主要通过栓塞肿瘤的供血动脉，阻断肿瘤的血供，导致肿瘤缺血、缺氧，达到抑制肿瘤生长、促使肿瘤细胞坏死凋亡的目的。与全身经脉给药相比，局部给药浓度大、效果好、疗效快、副反应轻微。动物模型研究发现TACE联合ATO能通过降低肿瘤组织中生存素（survivin）的表达促进肝癌原位小鼠肿瘤细胞的凋亡[63]。临床试验证实TACE联合ATO能显著提高肝癌存活率、降低肝癌肝外转移[64]。研究认为ATO可能通过抑制Twist的活化阻断肝癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增强TACE的治疗效果[24]。另外，研究发现与静脉相比，肝动脉可能更适合ATO发挥作用[65]。

4 ATO联合生物免疫治疗

肿瘤生物治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型疗法。它以肿瘤发生发展过程中的关键分子为靶点，以核酸、蛋白质或小分子化合物为治疗介质，以修饰肿瘤生物学行为为主要治疗目的，成为继手术、放疗和化疗之后的第4大肿瘤治疗技术。

4.1ATO联合溶瘤腺病毒

溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAd），在肿瘤细胞中复制后可以裂解肿瘤细胞，并释放出子代病毒，感染周围肿瘤细胞，直至完全杀灭肿瘤。OAd通过对腺病毒的基因改造使其复制具有肿瘤特异性，在功能正常的细胞中复制能力极低[66]。研究发现ATO粉针剂联合重组腺病毒介导的IκBαM能显著促进肝癌细胞凋亡[67]。另外，荷载PML蛋白的腺病毒（Ad-PML）联合ATO在体外体内均能显著降低肝癌细胞的生长[68]。

4.2ATO联合过继细胞免疫治疗

过继细胞免疫疗法（adoptive cell transfer therapy，ACT）是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，包括树突状细胞（dendritic cells，DC）疫苗、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokines induced killer，CIK）、γδT细胞、嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T lymphocytes，CAR-T）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）以及细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）。近年来，ACT在肝癌方面取得了显著的临床疗效[69-71]。

调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是肝癌发生免疫逃逸的关键，同时也是肝癌预后的独立影响因素[72-74]。研究发现ATO能选择性降低肿瘤动物模型体内的Treg水平[75]，打破肿瘤的免疫耐受。在肝癌原位模型中，我们发现ATO能引起免疫细胞在体内的重新分布。并且，ATO能提高CIK和CTL的体外杀伤活性。下一步我们将在小鼠体内评估ATO联合ACT的抗肿瘤效果。

5 总结和展望

从目前国内外的研究来看，ATO治疗肝癌疗效确切，但是ATO是药物还是毒物的争论依然是个永恒的话题[76-77]：ATO本身的致癌性[78-79]以及高浓度产生的细胞毒性[38]是ATO临床应用的“阿喀琉斯之踵”。因此，如何降低ATO治疗带来的毒副作用成为ATO临床应用的关键。一方面，我们可以因人而异，筛选出临床上对ATO敏感的肝癌患者进行个体化治疗。另一方面，我们既可以结合现代给药技术和给药方式达到减毒不减效的目的，又可以联合其他药物或治疗手段协同治疗肝癌，这也是未来ATO治疗肝癌的一个方向。

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（本文编辑：张海燕，鲁翠涛）

R735.7; R730.53

A

10.11952/j.issn.1007-1954.2016.06.001

2016-04-15

国家自然科学基金新疆联合基金项目（U1403222）；湖北省武汉市科技局项目（20160601010033）。

彭贵主（1961-），男，江西余干人，硕士，教授，主任医师，硕士生导师。

简介]叶啟发（1954-），博士，教授，博士生导师，E-mail:yqf_china@163.com。