结核分枝杆菌不同RNA提取方法的对比

谭 阳，尹 锐，徐亚维

(吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101)

结核分枝杆菌不同RNA提取方法的对比

谭 阳，尹 锐，徐亚维

(吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101)

分别采用玻璃珠处理法、超声破碎和甲醇裂解法对结核菌细胞壁处理后进行提取。结果表明：甲醇裂解法提取的RNA浓度和纯度较高，完整性也最好。玻璃株法次之，超声波法有降解。虽然三种方法提取的RNA都能直接用于下一步实验操作，但甲醇裂解法效果更好。

结核杆菌；RNA；提取

结核杆菌是引起人畜共患传染病结核病的主要病原菌，可通过空气和畜产品等途径传给人或其他动物，尤其是牛结核病不但会给畜牧业带来严重影响，也威胁人类健康[1]。由于传统检测结核病诊断方法的局限性，不利于快速准确地诊断肺结核及其疗效，急需开发快速准确的检测方法[2]。

近年来，分子诊断技术为结核杆菌检测开辟了一条新路，如环介导恒温扩增检测技术、RNA恒温扩增技术、基因芯片技术等。但这些技术的应用都是以获得高质量结核杆菌的DNA和RNA为前提，而结核分枝杆菌的mRNA半衰期极短，细胞壁脂质含量又很高且细胞壁裂解困难，这些加大了结核分枝杆菌RNA提取的难度[3]。本研究分别采用玻璃珠处理法、超声破碎法和甲醇裂解法对结核菌细胞壁处理后进行提取，探讨三种方法对结核分枝杆菌RNA提取的效果，以期获得一种简单、高效的结核分枝杆菌RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

结核分枝杆菌H37Rv标准株(吉林市结核病防治研究所)；Trizol试剂(Invitrogen)；直径0.5mm玻璃珠(美国Sigma)。

1.2 试验方法

1.2.1 结核分枝杆菌菌悬液的制备

取H37Rv标准株，接种于改良罗氏培养基，37℃培养28～42d[4]。称取9份湿重约30mg的H37Rv标本，分别标记为玻璃珠法、超声波法和甲醇裂解法，每组设三个平行对照。

1.2.2 结核分枝杆菌总RNA的提取前处理

各加入1 mL Trizol 后涡旋振荡混匀，分别用三种破壁方法进行前处理。玻珠法加玻珠0.2 g，静止5 min；超声波法先-80℃放置10 min，沸水速融后240 W超声波处理3次，每次3 min，间歇15 s；分别加入200 μL氯仿，涡旋振荡1 min，冰置10 min。甲醇裂解法加入1 mL新配置的氯仿甲醇溶液(氯仿∶甲醇=3∶1)，涡旋振荡1 min，冰置10 min[5]。

1.2.3 结核分枝杆菌总RNA的提取

4℃，12 000×g离心15 min，取上层水相加入等量的异丙醇混匀，-20℃静置1 h。4℃，10 000×g离心10 min弃上请，70%乙醇洗2次，干燥后加DEPC水溶解。

1.2.4 结核分枝杆菌总RNA鉴定

取5 μL RNA样品进行1%的变性琼脂糖凝胶检测，判断RNA的完整性；并取1.5 μLRNA样品用快速微量紫外测定仪测定RNA的浓度和纯度。

2 结果与讨论

2.1 结核分枝杆菌RNA的浓度和纯度检测

由表1可知，三种方法均能获得一定浓度的RNA。其中甲醇裂解法提取的RNA浓度最高，为115.05 ng/μL，其OD260/280值甲醇裂解法最好，在1.9～2.0，OD260/230在2.0～2.3，说明此法提取的样品中，蛋白质、盐类等基本去除干净。其次为玻璃珠法，超声波法提取的RNA浓度最低，可能是产生了热量影响了RNA得率。

表1 三种方法提取结核分枝杆菌总RNA浓度和纯度测定Tab.1 Three extraction methods on total RNA concentration and purity determination from mycobacterium tuberculosis

2.2 结核分枝杆菌RNA的完整性检测

采用1%变性琼脂糖凝胶电泳对提取的结核分枝杆菌RNA进行完整性检测，图1中三种方法均看到了23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA三条带，但超声法中条带发生弥散现象，说明高热量导致RNA降解；而甲醇裂解法条带更明亮清晰，且23S近乎16S条带浓度的2倍，说明RNA较完整，无降解现象。玻璃珠法虽不如甲醇法好，但也可用于结核杆菌RNA的提取。

Lane 1: 甲醇裂解法；Lane 2:玻璃珠法；Lane 3:超声波法 Lane 1: methanolysis method; Lane 2: glass bead method; Lane 3: ultrasonic disruption图1 三种方法提取的结核分枝杆菌RNA完整性比较Fig.1 Comparison of the RNA integrity of mycobacterium tuberculosis extracted by three methods

3 结论

结核分枝杆菌由于其细胞壁脂质含量高，很难像其他细菌细胞一样用通用的裂解剂将结核分枝杆菌细胞快速裂解。本研究采用三种方法处理结核分枝杆菌细胞壁，并用Trizol进行 RNA提取，结果超声波法由于产生较大热量影响了RNA得率和完整性，玻璃珠法虽不如甲醇裂解法好，但避免了甲醇的毒性。甲醇裂解细胞壁法提取的结核分枝杆菌RNA 的得率明显高于其他两种方法，因为甲醇能迅速溶解脂质，瞬间穿透并破坏结核分枝杆菌的脂质细胞壁，使细胞质中的RNA释放[3]。因此，甲醇裂解法和玻璃珠法均可以用于RNA的提取，但甲醇裂解法更好。

[1] Shamim Akhtar，Sampa Sarkar，Abhishek Mishra，Dhiman Sarkar. A method to extract intact and pure RNA from mycobacteria[J]. Analytical Biochemistry，2011，(417)：286-288.

[2] M.D. Bashyam，A.K. Tyagi. An efficient and high yielding method for isolation of RNA from mycobacteria[J]. Biotechniques，1994，(17)：834-836.

[3] 贾红彦，李自慧，杜博平，等.结核分枝杆菌总RNA提取方法的比较研究[J].临床肺科杂志，2012，17(7)：1246-1248.

[4] 罗影殊，高文凤，黄偌颖，等.不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较[J].中国防痨杂志，2013，35(3)：183-186.

[5] 俞垭美，王姗姗，褚丽花，等.适用于结核分枝杆菌RNA抽提的实验方法学研究[J].临床肺科杂志，2016，21(4)：609-612.

Comparison of different methods of RNA isolation from mycobacterium tuberculosis

TAN Yang, YIN Rui, XU Ya-wei

(School of Bioengineering, Jilin Agricultural Science and Technology College, Jilin 132101, China)

The cell wall ofmycobacteriumtuberculosiswas extracted by glass bead treatment, ultrasonic disruption and methanolysis method respectively. The results showed that the concentration and purity of RNA extracted by methanolysis method was higher and the integrity was the best. Glass bead method was the second and ultrasonic method has the appearance of degradation. Although the three methods of RNA extraction can be directly used in the next step of the experimental operation, methanolysis method is better.

Mycobacteriumtuberculosis; RNA; Extraction

2016-09-15

吉林省科技厅自然科学基金项目(20140101021JC)；微生物学校级重点学科项目(吉农院合字2015第012号)；大学生科技创新项目(吉农院合字2014第023号)

谭阳(1992-)，女，学士。

徐亚维(1974-)，女，副教授，博士，e-mail：xuyaweilucky@163.com。

R446.5

B

1674-8646(2016)23-0016-02