谷氨酰胺转胺酶诱导交联发酵乳蛋白的体内抗氧化功效

吕建敏， 袁海娜

（1.浙江中医药大学动物实验研究中心，浙江 杭州 310053；2.浙江科技学院生物与生化工程学院/轻工学院，浙江杭州310023）

谷氨酰胺转胺酶诱导交联发酵乳蛋白的体内抗氧化功效

吕建敏1， 袁海娜2

（1.浙江中医药大学动物实验研究中心，浙江 杭州 310053；2.浙江科技学院生物与生化工程学院/轻工学院，浙江杭州310023）

为了研究微生物谷氨酰胺转胺酶诱导交联发酵乳蛋白（Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein，mTG-FPM）对D-半乳糖（D-gal）衰老模型小鼠的抗氧化活性的影响，试验设正常组、D-gal模型组、D-gal+0UmTG-FPM组、D-gal+1UmTG-FPM组、D-gal+ 3UmTG-FPM组和D-gal+VE阳性对照组共6组，每组10只C57BL/J小鼠。采用皮下连续注射D-Gal方式建立衰老小鼠模型。造模同时，FPM各组每天灌服1.5 g/kg mTG-FPM/FPM，D-gal+ VE阳性对照组每天灌服100 mg/kg的VE，模型对照和正常组每天灌服蒸馏水0.2 mL/10 g。连续灌胃8 w后，测定各组小鼠肝肾组织和血清中的相关抗氧化指标（CAT、SOD、GSH-Px MDA）。结果表明：D-Gal可显著降低衰老模型小鼠肝脏和血清中CAT及GSH-Px活性 （P＜0.01，P＜0.05）；显著降低肾脏和血清中的SOD活力 （P＜0.01，P＜0.05），显著升高MDA含量 （P＜0.01）。与模型组和0UmTG组相比，3UmTG组的肝脏CAT，1UmTG组血清CAT活性和3U mTG组肝脏GSH-Px活性显著升高 （比0UmTG组分别升高11.14%、35.57%和22.36%，P＜0.01，P＜0.05）；而3UmTG组肾脏中的MDA含量显著降低（比0UmTG组降低26.41%，P＜0.05）。因此，mTG诱导交联处理可在一定程度上改善FPM的体内抗氧化活性。

微生物谷氨酰胺转胺酶；发酵乳蛋白；体内；抗氧化

谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase，TG）是存在于动、植物和微生物中的一种酶，可催化分子间和分子内酰基转移反应，并能通过交联、氨基转移及脱酰氨基作用改性蛋白质[1-4]。微生物谷氨酰胺转胺酶 （Microbial transglutaminase，mTG）由链霉菌属（Streptoverticillum）的某些菌株发酵生产[2-5]，具有与谷氨酰胺转胺酶相同的改性蛋白质作用[5]，且成本较低，广泛应用于乳制品加工、奶酪生产、肉类加工、焙烤制品及可食性膜的生产等食品加工领域[4-5]。目前，在酸奶等发酵乳制品中使用mTG的研究主要是集中在增加凝胶强度，保持其质地平滑并提高稳定性等方面[4-5]。但mTG通过交联作用是否能改善发酵乳蛋白（Fermentation Milk Protein，FPM）的抗氧化功效还未见报道。

另一方面，自由基学说认为，过量的自由基对机体产生氧化性损伤是衰老发生的主要原因。D-半乳糖小鼠衰老模型是目前常用的一种诱发性衰老模型，其主要机制与D-半乳糖的过度氧化损伤作用有关，可导致机体细胞产生大量的自由基，加速衰老过程[6-7]。为充分验证mTG诱导交联发酵乳蛋白的体内抗氧化功效，作者参考毛根祥等[8]的方法复制D-半乳糖衰老小鼠模型，研究mTG诱导交联发酵乳蛋白对D-半乳糖衰老模型小鼠组织和血清中抗氧化指标的影响，旨在明确mTG-PFM的体内抗氧化功效，为拓展mTG在乳制品中的应用方向，开发乳制品营养保健功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 D-半乳糖（D-gal）粉剂（原装）：购自Sigma公司；药用维生素E（水溶性制剂）：浙江新和成药业有限公司；批号分别为 2010914、20150915、20150916、20150922的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、 过氧化氢酶（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验动物 C57BL/6J小鼠60只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级，雌性，年龄为10周龄，体质量为18～22 g。试验在浙江中医药大学动物实验研究中心进行。

1.2 仪器和设备

DK-450B型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司；721型分光光度计：上海菁华科技有限公司；X-15R离心机：Beckman Coutler公司。

1.3 实验方法

1.3.1 mTG诱导交联发酵乳蛋白（mTG-FPM）制备

将浓度为0、1、3 U/g蛋白质的mTG分别与乳酸菌一起进行酸乳发酵，经均质、高速离心和冷冻干燥，制备出含mTG含量分别为0、1、3 U的FMP，标记为0U mTG-FPM，1U mTG-FPM和3U mTG-FPM。

1.3.2 动物分组及处理 试验设正常组，D-gal模型对照组、D-gal+0UmTG-FPM组，D-gal+1UmTGFPM组、D-gal+3UmTG-FPM组和D-gal+VE阳性对照组6个组别，将购入60只10周龄雌性C57BL/ 6J小鼠适应饲养2 w后，随机分为6组，每组10只，参照文献[8]的方法建立衰老小鼠模型，正常组采用等体积生理盐水皮下注射。FPM各组在造模的同时每天分别经口灌胃1.5 g/kg的FPM，D-gal+VE阳性对照组在造模同时每天经口灌胃100 mg/kg的VE，模型组和正常对照组每天经口灌胃蒸馏水0.2 mL/10 g。按以上方式处理8周后结束试验，采集各组小鼠血清、肝脏、肾脏样本，每组取8只动物样本，测定各样本血清以及肝脏和肾脏组织匀浆中CAT、MDA、SOD、和GSH-Px等指标。

1.4 统计学处理

采用SAS 8.1统计软件的ANOVA分析进行单因素方差分析，并进行Duncan氏多重比较，结果以X±s表示。

2 结果与分析

2.1 mTG-FMP对D-gal衰老小鼠肝、肾组织及血清中CAT活性影响

由表1可知，模型对照组小鼠肝脏和血清中的CAT活性均显著低于正常组（P＜0.01，P＜0.05）。3U mTG-FPM组和VE阳性对照组小鼠肝脏CAT活性显著高于模型对照组和0UmTG-FPM组 （P＜0.01，P＜0.05）。3UmTG处理组小鼠肝脏CAT活性比模型组和 0UmTG组分别提高 14.91%和11.14%。血清CAT活性以正常组和1UmTG-FPM处理组为高，均与模型对照组和0UmTG-FPM组差异显著（P＜0.05），其中，1UmTG处理组小鼠肝脏CAT活性比模型组和 0UmTG处理组分别提高41.21%和35.57%。

表1 小鼠肝脏、肾脏组织和血清中CAT活性测定结果Table 1 Activity of CAT in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

2.2 mTG-FMP对D-gal衰老小鼠肝、肾组织及血清中MDA含量影响

由表2可见，D-gal衰老模型小鼠肾脏和血清中MDA含量均显著高于正常小鼠（P＜0.01），说明D-gal衰老模型小鼠出现了衰老症状。mTG诱导交联处理可显著降低 D-gal衰老模型小鼠的肾脏MDA含量，3U mTG-FPM组的小鼠肾脏MDA含量显著低于模型组、0UmTG-FPM组和1UmTG-FPM组（P＜0.01），比0UmTG-FPM组降低26.41%。各FPM处理组小鼠血清MDA含量较模型组均有降低趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。VE阳性对照组小鼠肾脏MDA含量显著减低模型对照组和0UmTG-FPM组（P＜0.01），但与3UmTG-FMP组无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 mTG-FMP对D-gal衰老小鼠肝、肾组织及血清中SOD活性影响

mTG-FMP对D-gal衰老小鼠肝、肾组织及血清中SOD活性影响的结果见表3。D-gal处理显著降低衰老小鼠肾脏和血清中的SOD活性（P＜0.01，P＜0.05）。在肾脏中，3个FMP处理组和VE阳性对照组的SOD活性均极显著高于模型组 （P＜0.01）。VE阳性对照组小鼠血清SOD活性则显著高于模型组和0UmTG-FPM组，但与 1UmTG-FPM和3UmTG-FPM组差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明，无论与mTG是否交联，FMP均可极显著提高衰老小鼠肾脏SOD活性，说明FMP本身也具有一定的抗氧化功能。

2.4 mTG-FMP对D-gal衰老小鼠肝、肾组织及血清中GSH-Px活性影响

小鼠肝、肾组织及血清中GSH-Px活性检测结果见表4。D-gal衰老模型小鼠的肝肾组织和血清中的GSH-Px活性均显著低于正常小鼠（P＜0.01， P＜0.05），说明模型成立。3UmTG-FPM组和VE阳性对照组小鼠肝脏GSH-Px活性显著高于模型对照组和0UmTG-FPM组（P＜0.01），二者分别比0UmTGFPM组升高22.36%和26.22%。在肾脏中，3U mTGFPM组和VE阳性对照组的GSH-Px活性显著高于模型组（P＜0.05），说明经3UmTG处理的FPM的抗氧化功效与VE接近。

表2 小鼠肝脏、肾脏组织和血清中MDA含量测定结果Table 2 Content of MDA in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

表3 小鼠肝脏、肾脏组织和血清中SOD活性测定结果Table 3 Activity of SOD in liver，kidney tissues，and serum of mice（n=8，X±s）

表4 小鼠肝脏、肾脏组织和血清中GSH-Px活性测定结果Table 4 Activity of GSH-Px in liver，kidney tissues，and serum（n=8，X±s）

3 讨论

D-半乳糖致衰老动物模型是目前常用的一种模型，其致衰老的主要原因在于机体细胞受到D-半乳糖攻击后，其自身抗氧化能力过度受损[9]。因此，该模型常用于体内抗氧化和抗衰老功能的评价体系[8]。实验结果表明，连续注射D-gal 8 w后，小鼠的肝脏和血清中CAT及GSH-Px活性及肾脏和血清中SOD活性显著升高，而肾脏和血清中MDA含量显著降低，表明本研究所建立的衰老小鼠模型成立。

已有研究显示，乳蛋白中酪蛋白、乳铁蛋白、乳清蛋白及其酶解产物（乳清多肽）均具有一定的抗氧化活性[10-12]，在本实验中也发现FMP本身也具有一定抗氧化活性。乳蛋白抗氧化功能主要源于其内部抗氧化肽的作用，且抗氧化肽的功效与氨基酸组成、序列/结构及疏水性等物化特性密切相关[13-14]。目前，有关mTG交联处理的抗氧化作用的研究报道较少，仅有一些研究也存在争议，如O’Sullivan等[2，15]研究发现，mTG交联作用未影响乳清蛋白分离物和总乳蛋白的抗氧化活性，也未改变酪蛋白酸钠水解物在Jurkat T细胞内的抗氧化活性；而Song和Fan等[16-17]研究发现，mTG交联作用提高了大豆蛋白及其水解物的体外DPPH自由基清除活性和还原力，交联作用提高了1 000~5 000低相对分子质量肽的含量。导致以上研究结果差异的原因可能在于不同研究的抗氧化肽来源、组成以及所选抗氧化体系的不同。选用D-半乳糖衰老小鼠模型，对mTG交联发酵乳蛋白的体内抗氧化功效进行系统评价。结果表明，灌服经mTG处理的FMP后，衰老小鼠肝肾组织和血清中的抗氧化酶和脂质过氧化物均有改善，在肝脏和血清CAT、肝脏GSH-Px，肾脏MDA等指标上与mTG未处理组具有差异显著性，在其他抗氧化活性指标上，mTG交联发酵乳蛋白的抗氧化效果也基本与维生素E相近。表明mTG在提高发酵乳蛋白的抗氧化功效方面具有一定的作用，可能是由于mTG的交联作用改变了FPM中抗氧化肽的物化特性。此结果不仅为开发乳制品的天然保鲜剂提供了新思路，也为有效利用发酵乳的潜在营养保健功能提供了参考。

4 结语

综上所述，经mTG诱导交联处理的FPM与未经处理的FPM相比，可使D-gal衰老模型小鼠的肝脏和血清中的CAT活性，肝脏GSH-Px活性和肾脏中的MDA含量得到显著改善，因此mTG诱导交联处理在一定程度上提高了FPM的体内抗氧化活性，但其作用机制和剂量关系还有待进一步研究。

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Anti-Oxidative Activity of Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein in vivo

LU Jianmin1， YUAN Haina2
（1.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310053，China；2.School of Biological Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China）

The study was carried out to investigate the anti-oxidative effect of Microbial Transglutaminase Cross-Linked Fermentation Milk Protein（mTG-FPM）in aging mice induced by D-galactose（D-gal）.Sixty C57BL/6J female mice（12 w old）were divided into 6 groups including the control group，D-gal model group，D-gal-induced mice treated with FPM cross-linked mTG by 0U，1 U and 3 U/g protein（as D-gal+0 UmTG-FMP，D-gal+1UmTG-FMP and D-gal+3 UmTG-FMP groups），at 1.5 g/kg bw via ig，and D-gal-induced mouse treated with vitamin E as the positive group at 100 mg/kg via ig，respectively.After continuous administration for 8 weeks，the anti-oxidative parameters（CAT，SOD，MDA GSH-Px）in liver，kidney tissues，and serum of mice in each group were determined.The results showed that mice induced by D-gal had lower CAT and GSH-Px activity in liver and serum，lower SOD activity of kidney and serum，and higher MDA content of kidney and serum，when compared with the normal mice（P＜0.01，P＜0.05）.Compared to the model and untreated FPM groups，FPM treated with mTG had higher CAT activities in liver tissue（3 U mTG treatment，P＜0.01）and in serum（1 U mTG treatment，P＜0.05）up to 11.14%and 35.57% respectively，whereas the content of MDA in kidney tissue（P＜0.01）in FPM treated with mTG was reduced 26.41%.The activity of GSH-Px in liver tissue was also sharply higher（22.36%increase）in D-gal+3 U mTG-FPM group than that of in FPM group untreated with mTG （P＜0.01）.It was concluded that the mTG Cross-linked effect in FPM can improve the anti-oxidative ability of aging mice induced by D-gal.

microbial transglutaminase （mTG），fermentation milk protein （FPM），in vivo，anti-oxidative ability

TS 252.54

A

1673—1689（2016）12—1330—06

2015-04-05

浙江省自然科学基金项目（LY14C200007）。

吕建敏（1971—），女，浙江嵊州人，农学博士，研究员，主要从事动物营养方面的研究。E-mail：ljm6666@163.com