不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

刘 萍， 马全英， 宋玉霞， 刘学荣， 牟克斌， 王超英， 董金杰

(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046)



不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

刘 萍， 马全英， 宋玉霞， 刘学荣， 牟克斌， 王超英， 董金杰*

(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046)

摘要[目的] 验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞，通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显，都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用，与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。

关键词牛血清；悬浮培养；BHK21细胞

血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液体,具有维持血液黏度、酸碱度、渗透压等作用，主要由水和各种化学成分组成，这些化学成分包括白蛋白，α1、α2、β、γ-球蛋白，甘油三酯，总胆固醇，谷丙转氨酶等[1-2]。血清中含有丰富的营养成分，如蛋白质、生长因子、激素、营养物及代谢物等，为细胞培养的顺利进行提供了必要的营养保障。血清支持细胞的生长和繁殖能力是细胞培养过程中评价血清质量最主要的指标之一，血清的选择对细胞的培养具有十分重要的意义。研究表明，经聚乙二酸(PEG)处理的成年牛血清可维持细胞培养需要的营养物质，用于病毒或抗体的制备。笔者通过对胎牛血清、新生牛血清和处理的成年牛血清悬浮培养BHK21细胞，研究其增殖情况，以分析这3种血清促细胞生长的作用[3-4]。

1材料与方法

1.1血清来源胎牛血清购自gibco公司，批号：16000-044；成年牛血清购自郑州益康生物工程有限公司，批号：201408021；新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司，批号：20131221。

1.2细胞与培养基低血清悬浮细胞BHK21为中农威特生物科技股份有限公司驯化保存，低血清悬浮培养基为清大天一产品。

1.3试剂与仪器倒置显微镜，细胞分析仪(德国CASY)，摇床(ZHWY产品)，三角玻璃瓶等。

1.4成年牛血清的处理成年牛血清经PEG处理后，过滤除菌。将处理后的成年牛血清进行蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体检测。

1.5不同血清细胞培养试验分3组，配制含10%的胎牛血清、新生牛血清和处理的成年牛血清的培养基。将悬浮BHK21细胞种子以约40万/mL的接种量接种于含200 mL培养基的三角玻璃瓶内，于37 ℃，90 r/min摇床培养，培养48 h，检测细胞生长情况并进行细胞传代培养，细胞传10代培养，观察细胞生长情况，并对细胞进行形态观察、细胞密度与细胞活力、微生物以及代谢等方面的检测。

2结果与分析

2.1处理的成年牛血清检测结果经检测，未处理的成年牛血清中口蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体均为阳性，胎牛血清和新生牛血清中口蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体均为阴性，处理后的成年牛血清中口蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体均为阴性(表1)。

表1处理后成年牛血清中口蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体检测结果

Table 1The detection results of foot and mouth disease antibody and bovine viral diarrhea antibody of processed adult bovine serum

血清类型Serum口蹄疫抗体Footandmouthdiseaseantibody牛病毒性腹泻抗体Bovineviraldiarrheaantibody未处理的成年牛血清Untreatedadultbovineserum阳性阳性处理的成年牛血清Processedadultbovineserum阴性阴性胎牛血清Fetalbovineserum阴性阴性新生牛血清Newbornbovineserum阴性阴性

2.2细胞在不同血清中的形态BHK21细胞经悬浮培养48 h后，3种血清培养基培养的细胞均生长旺盛，饱满透亮，生长良好，无明显差异(图1)。

注：A.胎牛血清培养基；B.新生牛血清培养基；C.成年牛血清培养基.Note: A　 Culture medium of fetal bovine serum; B. Culture medium of newborn bovine serum; C. Culture medium of adult bovine serum.图1　血清培养基悬浮培养BHK21细胞形态Fig.1　The morphology of serum medium suspension culture of BHK21 cells

2.3细胞在不同血清中的生长情况BHK21细胞经悬浮培养48 h后，3种血清培养基培养的细胞，细胞倍增时间在20 h左右，细胞密度均达300万/mL以上，活力都在90.0%以上。细胞传10代培养，10次试验结果具有良好的重复性，细胞密度、细胞活力无明显差异(表2)。

表23种血清培养基悬浮培养BHK21细胞48 h后的细胞密度和细胞活力

Table 2　Culturing results of 48 h in three kinds of serum medium

2.4细胞在不同血清中的代谢情况由图1可知，在不同血清培养基中，细胞培养上清中的葡萄糖均随着培养时间的延长而逐渐降低，培养前期下降较快，中后期下降减缓，至培养结束时，细胞培养上清中的葡萄糖浓度降至最低，分别为1.35、1.42、1.55 mmol/L。由图2可知，在不同血清培养基中，细胞培养上清中的乳酸浓度均随着培养时间的延长而不断积累，72 h时最大浓度分别为5.52、6.77、6.81 mmol/L。

图1　不同血清培养基中葡萄糖消耗变化Fig.1　Changes of glucose consumption

图2　不同血清培养基中乳酸浓度变化Fig.2　Changes of lactic acid concentration

2.5细胞在不同血清中的微生物污染情况

2.5.1细菌及真菌。肉眼及显微镜观察均未发现培养液浑浊及存在活动的颗粒物。

2.5.2病毒。在细胞培养过程中,利用倒置相差显微镜观察均未见病毒引起的细胞病变现象。

3结论与讨论

细胞的生长是衡量血清质量的一种评价方法。该试验通过悬浮培养BHK21细胞来衡量胎牛血清、新生牛血清和成年牛血清的促细胞生长情况，结果表明，3种培养基培养的细胞增殖较快，活力较高，均生长较好，说明3种血清都能够满足细胞生长过程中所需的营养成分。

胎牛血清绝大部分的物质来自于母体，含有丰富的胚胎发育过程中必需的一些生长因子和激素等，新生牛血清这些成分相对较少，新生牛血清和胎牛血清在细胞培养过程均能够提供必需的营养成分。随着牛月龄的增长，血清中不利于细胞培养的抗体、补体等成分增加，对于细胞生长增殖而言，这些大分子蛋白质是一种异源物质，给细胞增殖带来不利影响。该试验成年牛血清经PEG处理后，口蹄疫抗体和牛病毒性腹泻抗体检测结果2种抗体均为阴性，表明成年牛血清经PEG处理后，除去大部分不利于细胞生长的抗体、补体等大分子蛋白，而剩余的能够满足细胞培养的营养成分，与报道结果一致[5]。经PEG处理的成年牛血清除去了不利于细胞生长的大分子物质，从而保持了维持细胞生长的营养物质。该方法简单，易于操作，成本廉价，且成年牛血清来源丰富，价格便宜，该研究为寻找一种替代新生牛血清或胎牛血清的方法奠定了基础。

参考文献

[1] 宋红英，高丽美，顾春燕，等.牛血清蛋白含量的高低对细胞生长的影响[J]. 浙江省医学科学院学报，2005(3):37-39.

[2] 李倬，乔自林，冯玉萍,等.促细胞生长效应实验对牛血清采血年龄的判断的讨论[J].西北民族大学学报，2003,24(3)：59-62.

[3] BARTELING S J.Use of polyethyleneglycol-treated serum for production of

foot-and-mouth disease virused cell cultures, in growing BHK-suspended cell cultures[J].Bull off Int Epizoot,1974,81(11/12):1243-1254.

[4] HANSEN M B,NIELS A S E,BERG K.Peaxaminnation and forther development of a precise and rapid dye method for measuring cell grow[J].Immunol methods,1989,119(2):203-210.

[5] MOSAN T.Rapid colorimetrie assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxivity assays[J].Journal of immunologial methods,1983,65(12):55-63.

The Effect of Different Bovine Serum on Promoting the Growth of BHK21 Cells in Suspension Culture

LIU Ping, MA Quan-ying, SONG Yu-xia, DONG Jin-jie*et al (China Agricultural Veterinary Biological Science and Technology Co. Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

Abstract[Objective] To verify the effect of bovine serum on promoting cells growth during cultivation process. [Method] Suspension culture of BHK21 cells was conducted by using commodity fetal bovine serum, newborn bovine serum and processed adult bovine serum respectively. The effect of each serum on promoting cells growth was tested through indicators of cell density and cell vitality. [Result] The difference among three kinds of serum on cell growth was not obvious, and they all had good effects on promoting cell growth. [Conclusion] The processed adult bovine has good effect on promoting cell growth, and has no obvious differences with that of fetal bovine serum and newborn bovine serum.

Key wordsBovine serum; Suspension culture; BHK21 cells

收稿日期2015-12-21

作者简介刘萍(1977- )，女，山东单县人，助理研究员，硕士，从事疫苗相关方面的研究。*通讯作者，副研究员，硕士，从事疫苗相关方面的研究。

中图分类号S 188+.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)02-177-03