基于7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光平台检测谷胱甘肽

陈 敏， 许庆山， 赵成飞， 陈萍萍， 吴旸婷， 翁少煌， 林新华

基于7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光平台检测谷胱甘肽

陈 敏1， 许庆山1， 赵成飞2， 陈萍萍2， 吴旸婷2， 翁少煌2， 林新华2

目的 构建7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光平台检测谷胱甘肽并用于药物质量控制。 方法 化学法合成MnO2纳米薄片并用于吸附7-OH香豆素形成复合体系，由于MnO2纳米薄片的内滤效应使得7-OH香豆素的荧光猝灭。谷胱甘肽(GSH)可与MnO2发生氧化还原反应，MnO2转变为可溶性的Mn2+从而释放出7-OH香豆素，恢复荧光。对比GSH加入前后荧光的恢复程度，荧光信号增大的幅度与GSH浓度正相关，可实现对GSH的高灵敏检测。 结果 该荧光平台可选择性识别GSH。在优化的实验条件下，荧光恢复值与GSH在0.03～400 μmol/L呈线性关系，检测限为0.01 μmol/L。 结论 构建的7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光平台可简便、准确地检测GSH，可用于实际药品中GSH的测定。

谷胱甘肽； 香豆素类△； 锰化合物； 荧光计； 药用制剂/*分析； 质量控制

还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种重要的非蛋白类物质和抗氧化剂，可以调整体内细胞的正常增殖[1-2]。GSH浓度的变化与癌症、肝损伤、艾滋病、机体老化、糖尿病等相关；GSH的监控也是药物质量控制的重要指标[3-5]。因此，GSH的定性定量检测对研究机体生理状态具有重要的作用。荧光分析法因其灵敏度高、操作简单、费用低而被广泛地应用于药物分子和离子的测定，它可以通过与目标待测分子作用，从而产生因目标诱导的荧光变化，且信号变化值与目标物的浓度呈直接关系[6-7]。香豆素类衍生物含有苯并吡喃酮结构，可发射蓝光，具有荧光量子产率高和光稳定的优点，被广泛地应用于生物实验中。二氧化锰(MnO2)纳米薄片可吸附荧光量子点材料并猝灭荧光，用于建立信号开关型的荧光检测体系[8-9]。本研究拟制备MnO2纳米薄片，与7-OH香豆素作用形成荧光猝灭的香豆素-MnO2纳米复合体系(7-OH香豆素-MnO2复合体系)定量检测GSH[10]，探索发展药物质量控制新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光分光光度计(Cary eclipse，美国安捷伦科技有限公司)；紫外可见分光光度计(UV-2450，日本岛津公司)；四甲基氢氧化铵(批号：MKBT8964V)和二氯化锰溶液(MnCl2)(批号：SLBB9634V)，购自美国Sigma-Aldrich公司；GSH(反应级，批号：LN30P109)和7-OH香豆素(批号：L140Q74)购自百灵威科技有限公司；不同pH值的10 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(HAc-NaAc)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(Na2HPO4-CA)、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲液(PBS)和柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(NaCA-CA)的原料均从国药集团化学试剂有限公司购买并于实验室自制。所有试剂除特别说明外均为分析纯，实验用水为Millipore超纯水。

1.2 方法

1.2.1 MnO2纳米薄片的制备 称取2.174 7 g四甲基氢氧化铵和0.593 8 g MnCl2·4H2O，分别溶解于20 mL和10 mL的去离子水中。在20 mL的四甲基氢氧化铵溶液中加入0.6 mL的30% H2O2，并在搅拌的情况下将其全部加入到10 mL的MnCl2溶液中，15 s内立即变成黑褐色并产生烟。持续搅拌过夜反应14 h。后将得到的产物离心(2 000 r/min，20 min)并用去离子水和甲醇分别洗涤3次。洗涤后的产物于60 ℃干燥、备用，得到干燥的MnO2纳米薄片约1.52 g。取40 mg MnO2纳米薄片溶解于20 mL的去离子水中(2 mg/mL),超声处理得到分散物。

1.2.2 7-OH香豆素-MnO2复合体系的制备 取30 μL浓度为28 μg/mL的7-OH香豆素溶液，加入 60 μL 2 mg/mL的MnO2溶液，用碳酸氢钠-柠檬酸缓冲液(10 mmol/L，pH 5.5)稀释至300 μL，室温下振荡反应数分钟后得到复合体系。

1.2.3 GSH荧光的检测 取制备好的7-OH香豆素-MnO2复合体系，加入一定浓度的GSH，在50 ℃下反应 30 min后，转移到350 mL的石英比色皿中，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为5 nm，电压680 V，在激发波长326 nm处进行荧光测定。

1.2.4 GSH片剂的检测 称量10片还原性GSH片，计算平均片重，研细，取100 mg溶解于10 mL水中，过滤后备用。适当稀释并以1.2.3的实验条件进行测定，并根据2015版中国药典要求计算百分标示含量。

1.2.5 注射用GSH的检测 将GSH干冻粉(600 mg)加入5 mL去离子水溶解，备用。采用加样回收率实验对注射用GSH进行检测。以1.2.3的相同条件下进行测定，并根据2015版中国药典要求计算百分标示含量。

2 结 果

2.1 7-OH香豆素与 7-OH香豆素-MnO2复合体系的光学表征 紫外可见吸收光谱和荧光激发、发射光谱对7-OH香豆素、MnO2纳米薄片，7-OH香豆素-MnO2复合体系进行表征(图1)。7-OH香豆素在325 nm处有一个最大紫外吸收峰，MnO2纳米薄片在300～500 nm有一个宽的吸收带[12]；GSH无明显的吸收峰；7-OH香豆素-MnO2复合体系在300～500 nm处有2个吸收峰，325 nm处表现出比7-OH香豆素宽并重叠的吸收峰，在375～500 nm处有一个类似MnO2的宽吸收峰；7-OH香豆素-MnO2复合体系中加入GSH后，在325 nm处表现出归属于7-OH香豆素吸收峰且相比于7-OH香豆素-MnO2复合体系在325 nm处的吸收值增大，而归属于MnO2位于375～500 nm的宽吸收峰有所降低(图1A)。7-OH香豆素的荧光光谱发射光谱和激发光谱可见7-OH香豆素在326 nm处激发，在458 nm处最大发射(图1B)。对比图1A和1B可知，位于458nm的发射波长刚好落在MnO2的300～500 nm的宽吸收峰。

2.2 7-OH香豆素-MnO2复合体系检测GSH的荧光表征 对比不同浓度的GSH加入到7-OH香豆素-MnO2复合体系前后的荧光变化(图2)。7-OH香豆素中加入MnO2形成7-OH香豆素-MnO2复合体系，7-OH香豆素的荧光明显降低，荧光猝灭；加入不同浓度的GSH后，原先被猝灭的荧光逐渐恢复，随着加入GSH浓度的增加而荧光增强，检测1.0 mmol/L的GSH可以完全恢复7-OH香豆素原先的荧光强度。增强的荧光强度(ΔF)可用于GSH的定量。

2.3 7-OH香豆素-MnO2复合体系检测GSH的条件优化

2.3.1 MnO2浓度优化 MnO2纳米薄片吸附7-OH香豆素引起荧光猝灭。首先对MnO2的浓度进行优化，随着MnO2浓度的增大，7-OH香豆素的荧光强度逐渐降低。当MnO2浓度为0.4 mg/mL的时候，荧光强度最低(图3)。

2.3.2 GSH测定体系中缓冲溶液种类及pH优化 使用NaH2PO4-CA缓冲液在pH 3～10进行pH筛选，可知在pH 5.5的时候荧光恢复值(ΔF)最强(图4A)。在此pH条件下，考察不同冲液加入0.5 mmol/L GSH前后的ΔF变化情况，其中 NaH2PO4-CA缓冲液的ΔF变化最大(图4B)。选择pH 5.5的NaH2PO4-CA缓冲液为最佳的溶液反应体系。

2.3.3 GSH测定体系中温度及反应时间优化 对比30 min时不同温度的ΔF，在50 ℃的时候最大(图5A)。考察50 ℃的条件下检测GSH时的动力学反应过程，在25 min时反应达到平衡，且后续荧光值保持稳定(图5B)，故50 ℃下反应25 min为最适的反应温度和时间。

2.4 GSH检测的特异性 常见的金属离子不会对7-OH香豆素的荧光响应产生显著影响(图6A)。在相同的测定条件下，除了半胱氨酸(Cys)含有与GSH一样的巯基基团，可以恢复荧光，其他的生物分子(多巴胺、抗坏血酸和多种氨基酸)不会恢复7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光(图6B)。

2.5 GSH的定量检测

2.5.1 GSH标准曲线的绘制 用7-OH香豆素-MnO2复合体系在最佳的反应条件下测定一系列不同浓度的GSG标准溶液，探讨GSH浓度与7-OH香豆素的荧光强度恢复值(ΔF)的关系。随着GSH浓度增加，其荧光强度逐渐加强(图7A)。当GSH在0.03～400 μmol/L内，其浓度与ΔF呈正相关(图7B)，其线性方程为ΔF=1.769 4CGSH+18.797 5，R2=0.990 4，检测限为0.01 μmol/L(S/N=3)。

2.5.2 还原型GSH片剂和冻干粉中GSH的含量测定 以还原型GSH片剂和冻干粉作为代表性实际样品，加入特定稀释倍数的片剂或者冻干粉，测定其荧光强度，以标准曲线(△F=1.769 4CGSH+18.797 5)测定浓度，并根据药典要求，计算得到片剂和冻干粉的百分标示含量分别为102.7%和97.7%，符合药典规定的百分标示含量(95.0%～105.0%)。

3 讨 论

紫外可见吸收光谱和荧光光谱可用于荧光染料(材料)的光学性质及其变化的测定。由于7-OH香豆素的π-π*跃迁，其最大紫外可见吸收峰位于325 nm。7-OH香豆素-MnO2复合体系在紫外可见吸收光谱中325 nm位置的吸收峰和375～500 nm范围的宽吸收峰表明所制备的7-OH香豆素-MnO2复合体系包含了7-OH香豆素和MnO2的各自性质，且其中位于375～500 nm范围的宽吸收峰是由于MnO2八面体结构的d-d跃迁引起的[11]。7-OH香豆素最大发射波长位于458 nm的荧光发光光谱刚好位于MnO2的宽吸收峰范围，可以发生内滤效应，从而使得7-OH香豆素-MnO2复合体系中香豆素的荧光发光光谱被MnO2所吸收而猝灭荧光[11]。

7-OH香豆素-MnO2复合体系猝灭的荧光随着GSH的加入而逐渐恢复，这是由于GSH具有还原性，与MnO2纳米薄片反应并将MnO2还原成可溶性的Mn2+，释放出原先吸附在MnO2纳米薄片表面的7-OH香豆素，从而恢复荧光。随着加入GSH浓度的增加，荧光恢复程度(ΔF)增强。因此，选择GSH加入前后荧光恢复程度(ΔF)定量检测GSH的浓度。

MnO2纳米薄片通过吸附7-OH香豆素而形成荧光猝灭体系，其浓度会影响7-OH香豆素的猝灭效率。随着MnO2浓度的增大，7-OH香豆素的荧光强度逐渐降低，因此选用适量的MnO2纳米薄片可有效吸附7-OH香豆素以形成检测GSH的荧光平台。合适的缓冲液类型及pH有利于MnO2与GSH氧化还原反应的进行以提高GSH的检测性能。温度的升高有利于反应的进行从而提高荧光恢复值，但温度过高会加剧荧光分子间的碰撞而降低荧光恢复值。MnO2与GSH反应需要一定的时间，荧光恢复值随时间延长先增大后趋于稳定，反应完成，从而完全释放7-OH香豆素。

生物体系、药物中成分复杂繁多。通常情况下，金属离子如Fe3+，Cu2+等会对荧光染料或材料产生猝灭作用[6,12]，因此首先对比多种金属离子对7-OH香豆素荧光响应的影响。本研究结果显示，较高浓度的金属离子不会影响7-OH香豆素的荧光响应。在相同实验条件下，除了Cys因含有与GSH一样的巯基(-SH)将MnO2纳米薄片还原成Mn2+，可以使7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光恢复，而其他的生物分子不会恢复7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光。由于常见的药物中几乎不添加Cys，因此，应用7-OH香豆素-MnO2复合体系可以选择性地检测药物中GSH。

在优化的条件下，应用7-OH香豆素-MnO2复合体系测定不同浓度的GSH。随着GSH浓度的增大，7-OH香豆素的荧光逐渐恢复增强，△F逐渐增大。GSH在0.03～400 μmol/L范围内，△F与GSH浓度呈线性关系，其线性方程可用于实际体系中GSH含量的定量分析。根据信号/背景值为3(S/N=3)的关系得到本方法测定GSH的检测限(0.01 μmol/L)较低，可以满足生物体系、药物分析等方面检测的要求。还原型GSH片剂和冻干粉测定的百分标示含量符合2015版中国药典的要求，说明本方法测定实际药物的准确度。

综上所述，本研究发展并建立基于7-OH香豆素-MnO2复合体系的荧光信号平台，建立了简便、快速、准确的GSH测定新方法，可进一步发展此技术用于实际药品生产、流通、经营、管理过程中GSH的测定。

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(编辑:张慧茹)

Fluorescent Platform Based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2Composites for Glutathione Sensing

CHEN Min1, XU Qingshan1, ZHAO Chengfei2, CHEN Pingping2,WU Yangting2, WENG Shaohuang2, LIN Xinhua2

1. Department of Orthopedic Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China；2. Department of Pharmaceutical Analysis, Faculty of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

Objective To construct a fluorescence platform based on 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites for the detection of glutathione and for its application in drug quality control. Method MnO2nanosheets prepared by chemical method were used for the adsorption of 7-OH to form a composite system. Due to the internal filtering effect of MnO2nanosheets, the fluorescence of 7-Hydroxycoumarin was quenched. The introduction of glutathione (GSH) reacted with MnO2through redox reaction, and MnO2was transformed into soluble Mn2+to release absorbed 7-Hydroxycoumarin therefore recovered the quenched fluorescence. Compared the change in fluorescence intensity before and after the addition of GSH, the magnitude of the increase in fluorescence signal was positively correlated with the GSH concentration, therefore the high sensitive detection of GSH could be realized. Result The fluorescence platform can selectively recognize GSH. Under the optimized experimental conditions, the fluorescence recovery value was correlated with the GSH in the range of 0.03 μmol/L to 400 μmol/L in a linear relationship, and the detection limit was 0.01 μmol/L. Conclusion The construction of 7-Hydroxycoumarin-MnO2composites can be used to detect GSH easily and accurately in medicinal testing.

glutathione； coumarins△； manganese compounds； fluorometry； pharmaceutical preparations/*analysis； quality control

2016-06-23

国家自然科学基金(21405016)；福建省自然科学基金(2015J01475,2015J01043)；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2013-ZQN-JC-16)

福建医科大学 1.附属协和医院 骨科，福州 350001； 2.药学院 药物分析学系，福州 350108

陈 敏(1976-)，男，副主任医师，医学博士

翁少煌. Email: shweng@fjmu.edu.cn

R341.6

A

1672-4194(2016)06-0349-05