柴郁地仙方对围绝经期抑郁症模型大鼠行为学及HPG轴的影响※

● 李丽丽 朱红梅

柴郁地仙方对围绝经期抑郁症模型大鼠行为学及HPG轴的影响※

● 李丽丽 朱红梅▲

目的：探讨柴郁地仙方抗围绝经期抑郁症的作用途径。方法：50只SD大鼠分为假手术组、模型组、盐酸氟西汀组、戊酸雌二醇组、柴郁地仙方组，每组10只，假手术组行假手术，其余行卵巢去势术后孤养并予以21d慢性轻度不可预见性刺激，观察刺激过程大鼠行为学变化，采用Elisa法检测血清E2、FSH、LH水平。结果：柴郁地仙方能够维持大鼠Open-Field水平得分稳定，上调血清E2水平，抑制血清FSH、LH过度分泌，与模型组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论：柴郁地仙方能改善围绝经期抑郁症大鼠行为，其机制可能与纠正HPG轴功能紊乱相关。

柴郁地仙方 围绝经期抑郁症 HPG轴

围绝经期抑郁症(PDD)是指初发于围绝经期，以持续的情绪抑郁为主要特征的一种情感障碍性疾病[1]。抗抑郁与激素替代疗法对本病的治疗具有一定的效果，但由于PDD本身发病的复杂性及药物潜在的副作用，患者依存性较差[2-3]。中医学主张整体观念与辨证论治相结合，对疾病的治疗有多靶点、毒副作用小、依从性好的优点。中药复方柴郁地仙方在治疗PDD的临床应用中疗效显著[4]，但药理机制尚不明确。本实验观察柴郁地仙方对PDD模型大鼠行为学及下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴的影响。

1 材料

1.1 药物 柴郁地仙方：柴胡12g，郁金10g，熟地黄10g，仙灵脾10g，党参10g，茯苓10g，法半夏12g(免煎冲剂，江阴天江药业有限公司)；盐酸氟西汀胶囊(上海中西制药有限公司生产，生产批号：150102)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司生产，进口药注册号：H20120368，药品批准文号：国药准字J20130009)。

1.2 动物 SPF级SD大鼠50只，3～4月龄，体重(240±10)g，购自厦门大学实验动物中心[许可证号：SCXK(闽)2013-0001]。5只/笼饲养，食物与水充足供给，可自由摄取，饲养室温度(22±1)℃，相对湿度50%，光照时间7：00-19：00，适应饲养环境1周后开始实验。

1.3 主要试剂 大鼠雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成激素(LH)酶联免疫吸附测定(Elisa)试剂盒(上海优选生物科技有限公司，批次号分别为：20150725B、20150810B、20150725B)。

1.4 主要仪器 ZH-ZFT型旷场实验视频分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)；M2000多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，CKX31倒置显微镜(日本Olympus公司)，CHOL-16M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组 50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、盐酸氟西汀组、戊酸雌二醇组、柴郁地仙方组，每组10只大鼠，其中假手术组大鼠行假手术，其余4组大鼠均进行卵巢去势手术。

2.2 卵巢去势手术(Ovx)[5]大鼠经7%水合氯醛溶液(400ml/kg)腹腔注射麻醉后腹位固定，于最末肋骨下端、腋中线距脊柱外2cm处切开皮肤、筋膜及肌肉层，取出黄色脂肪包裹的黄红相间的卵巢组织，分离脂肪团，将卵巢、输卵管及周围脂肪一并结扎切除，将子宫放回原位，缝合肌肉和皮肤，用青霉素钠敷于伤口处。

2.3 假手术(SHAM)[6]取出大鼠黄色脂肪包裹的黄红相间的卵巢组织，确保卵巢及输卵管组织完整，仅切除卵巢周围部分脂肪团，将卵巢送回腹腔，逐层缝合，同法摘除对侧卵巢周围脂肪团，其它步骤与Ovx组相同。

2.4 大鼠动情周期观察 将蘸有生理盐水的棉拭子轻轻插入大鼠阴道内约1～2cm，轻轻旋转擦拭后取出，将棉拭子擦拭下的阴道分泌物均匀涂抹到载玻片上，于倒置电子显微镜下观察标本中半透明阴道上皮细胞数量，每日18：00进行，连续6d。阴道上皮细胞数量没有明显变化，说明手术清除卵巢成功；反之失败。假手术组大鼠涂片中上皮细胞数量应存在周期性变化。

2.5 抑郁模型制备[7]采用孤养与21d慢性轻度不可预见性应激(CUMS)相结合的方法建立抑郁模型。刺激包括：冰水游泳(4℃，5min)、热应激(45℃，5min)、夹尾(1min)、禁水(24h)、禁食(48h)、潮湿垫料(24h)、束缚(1h)、鼠笼倾斜(45°，24h)、昼夜颠倒、通宵照明，平均每种刺激2次，按顺序进行2轮。假手术组5只/笼常规饲养，不参与CUMS过程。

2.6 药物干预 假手术组、模型组予生理盐水灌胃，盐酸氟西汀组予盐酸氟西汀混悬液灌胃，戊酸雌二醇组予戊酸雌二醇混悬液灌胃，柴郁地仙方组予柴郁地仙方混悬液灌胃。药物按大鼠-人体质量等效剂量比6.3配制，4℃保存，0.1mL·kg-1体重灌胃，灌胃前加热至37℃，自CUMS开始第1d起至结束后1d，共22d，每日18：00进行。

2.7 行为学观察(Open-field实验) 于CUMS第1d、11d和21d早晨8：00-12：00昏暗安静环境下进行。实验旷场边长100×100cm，周壁高30cm，周壁及底部为黑色。观察者通过悬挂于敞箱之上的摄像头于计算机上观察动物情况并记录其5min内水平移动距离。每只大鼠仅进行1次测试。

2.8 标本取材 CUMS刺激21d后空腹饲养24h后，10%水合氯醛溶液，0.3mL/100g腹腔注射麻醉，下腹处剪除长毛后常规消毒，切开皮肤和腹肌，进行腹主动脉抽血，4℃低温储存备用。

2.9 血清E2、FSH、LH水平测定 血液标本4℃环境3000r/min离心15min，取上清液按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

3 结果

3.1 对Open-Field水平移动总距离的影响 CUMS刺激前各组大鼠水平移动总距离得分间差异无统计学意义(P>0.05)。CUMS后第1d开始给药干预，21d刺激结束后，停止药物干预。结果显示模型组水平得分显著下降(P<0.01)，造模成功。柴郁地仙方组与模型组比较，CUMS第11d及21d水平得分均显著提高(均P<0.01)。三种药物均能提高模型大鼠水平移动得分，然而，短期(CUMS第11d)、长期(CUMS第21d)效果存在差异：短期干预水平得分柴郁地仙方组显著高于两阳性药物组(均P<0.05)；长期干预水平得分柴郁地仙方组与盐酸氟西汀组差异无统计学意义(P>0.05)，显著高于戊酸雌二醇组(P<0.01)。见表1。

表1 Open-Field水平移动总距离得分

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与柴郁地仙方组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 对血清性激素水平的影响 Ovx手术合21d孤养与CUMS刺激配合药物干预后，模型大鼠血清E2水平显著下降(P<0.01)，FSH、LH水平显著升高(均P<0.01)。柴郁地仙方能够逆转这一变化，升高E2水平，降低LH、FSH水平，与模型组比较差异显著(均P<0.01)。柴郁地仙方对血清激素作用与戊酸雌二醇差异无统计学意义(P>0.05)。柴郁地仙方与盐酸氟西汀对模型大鼠血清E2水平影响差异无统计学意义，柴郁地仙方组血清FSH、LH水平显著低于盐酸氟西汀组(均P<0.05)。见表2。

表2 对血清性激素水平的影响(n=10)

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与柴郁地仙方组比较，#P<0.05。

4 讨论

本实验以Ovx方法建立一种内源性雌激素撤退的模型，以探究外源药物干预对激素水平的影响。该方法基本模拟了围绝经期女性卵巢功能衰退的生理状态，被广泛应用于围绝经期动物研究和激素研究中[8]。慢性抑郁状态模型的建立采用孤养与CUMS相结合的方法，具有应激因子多变性和不可预测性的特点，能够反映人类抑郁发生、发展机制[9]。假手术组大鼠保留卵巢功能，经动态阴道涂片观察后证明符合育龄期大鼠生理状态。模型组与药物干预组均行Ovx术及21d孤养与CUMS，动态阴道涂片观察已证明无内源性激素波动对实验结果造成影响，实验结果能够较为客观的评价药物干预对性腺轴的作用。

《素问·阴阳应象大论》云：“年四十而阴气自半。”《医学正传》认为：“月经全凭肾水施化，肾水既乏，则经血日以干涸。”围绝经期是一个缓慢的过渡阶段，自身存在肾精衰少的生理特征，目前中医界对于本病的治疗也主要以肾精不足为出发点，提倡补肾疏肝的治疗原则[10]。然而，抑郁发作与狂躁发作相对立，核心症状表现为情绪低落、兴趣缺乏、乐趣丧失[11]，基于阴阳对立统一的理论，本课题组认为PDD的发生一定原因是由于阳气的不足引起的。在选方过程中，重视本病临床症状特征，遵从围绝经期妇女生理特点，兼顾人体阳气，遵从“天之大宝只此一轮红日，人之大宝只此一息真阳”理论，选用“温而不燥，为燮理阴阳之佳品”的仙灵脾配合熟地黄以滋补肾阴，培补肾气，临床使用最善调节女性内分泌；柴胡、郁金疏肝解郁，活血行滞；半夏化痰除湿，和胃健脾，交通阴阳；茯苓、人参相伍健脾养心安神。全方阴阳兼顾，补肾疏肝，兼有活血化痰、养心健脾之功，切合围绝经期抑郁症阴阳失调，肾虚肝郁的基本病机。

本研究主要从大鼠行为学及血清性激素水平的角度探讨了柴郁地仙方治疗围绝经期抑郁症的作用机理。柴郁地仙方能够改善模型大鼠活动度降低情况，并抑制血清FSH、LH过渡分泌，使E2保持较为正常的水平，说明本方在抗PDD过程中能够对HPG轴产生影响。值得注意的是，柴郁地仙方对PDD模型大鼠有长期的抗抑郁症作用，且在短期时间内对行为学影响效果比临床抗抑郁常用药盐酸氟西汀效果显著，而其在对HPG轴的作用上效果优于盐酸氟西汀，与雌激素替代疗法常用药戊酸雌二醇效果相当。临床上对单纯抗抑郁治疗效果不明显的中年女性补充雌激素，能够明显改善抑郁症状，提示PDD的发病过程与HPG轴功能紊乱相关[12]，因此，寻得一种兼具抗抑郁与调节生殖内分泌效果的治疗方案有助于降低该病造成的社会负担。柴郁地仙方能够在改善患者抑郁状态的同时纠正HPG轴的紊乱，值得在PDD治疗中推广应用。

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福建省卫生厅资助项目(No.WZPW201307)

▲通讯作者 朱红梅，女，教授，主要从事经方治疗妇科病及围绝经期抑郁症相关研究。E-mail：z5913778@126.com

厦门大学医学院(361000)