正交试验法优化微波提取金丝桃苷工艺

胡小艳， 徐 蕾， 李博文

(1.万邦生化医药股份有限公司，江苏徐州 221004；2.上海海利生物技术股份有限公司，上海 201403)



正交试验法优化微波提取金丝桃苷工艺

胡小艳1， 徐 蕾1， 李博文2

(1.万邦生化医药股份有限公司，江苏徐州 221004；2.上海海利生物技术股份有限公司，上海 201403)

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)属于藤黄科金丝桃属，贯叶连翘中含有多种具有生物活性的化学物质，其中黄酮类化合物金丝桃苷(又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)就是其中之一。金丝桃苷具有多种药理活性，唐敏等[1]研究证明金丝桃苷可通过清除机体自由基而发挥其抗氧化作用，从而起到对肝脏的保护作用；章家胜等[2]分析表明金丝桃苷可以抑制神经细胞上的Ca2+而起到抑制疼痛的作用；陈红艳等[3]研究指出金丝桃苷能明显减轻大鼠的神经病学症状，减小血面积，降低脑含水量，减轻脑水肿；Li等[4]报道金丝桃苷能抑制由t-BuOH诱导引起的DNA碱基氧化及细胞中氧化还原状态变化，抑制促凋亡因子由细胞质转移到线粒体。此外，有不少文献报道金丝桃苷还具有抗炎[5]、抗血栓[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗抑郁[9]以及增强免疫[10]的作用。

金丝桃苷的提取方法主要有乙醇热回流提取、甲醇热回流提取、乙醇超声提取、甲醇超声提取等方法，由于传统方法所得产品纯度和收率过低，成为金丝桃苷进一步研究的瓶颈，微波可使贯叶连翘中的细胞膜和细胞壁破裂，促使金丝桃苷从细胞内释放，进而提高其提取率。该试验用微波技术提取贯叶连翘中的金丝桃苷，以金丝桃苷提取率为考察指标，对影响该指标的各因素进行系统性研究，通过单因素试验和正交试验设计优化提取工艺，以期为提高金丝桃苷的提取率提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂贯叶连翘饮片，兰州安泰堂中药饮片有限公司提供；金丝桃苷标准品(纯度≥95%)，Sigma公司；乙腈和甲醇，色谱纯，山东禹王实业有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备 高效液相色谱仪(美国Waters公司)；MAS-II型微波提取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；FA2004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Pine-tree纯水机(北京湘顺源科技有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1金丝桃苷提取。精密称取贯叶连翘饮片10.00 g于250 mL烧杯中，乙醇浸泡放置2 h使其溶胀，在微波处理器中辐射，抽滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，得到金丝桃苷提取物。

1.3.2溶液中金丝桃苷的含量测定。

1.3.2.1色谱条件。Agilent HC-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为水乙∶腈∶磷酸缓冲液=50∶40∶10；检测波长365 nm；流速1.0 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃。

1.3.2.2供试液制备 。将微波提取所得金丝桃苷提取物用甲醇稀释100倍，过0.45 μm有机滤膜，作为金丝桃苷供试液。

1.3.2.3标准曲线制备。精密称取10.00 mg金丝桃苷对照品，用10 mL甲醇溶解制成1 mg/mL金丝桃苷对照品甲醇溶液，用甲醇稀释得到0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μg/mL的标准溶液。按“1.3.2.1”色谱条件测定，所得平均峰面积分别为432 927、841 043、1 703 642、3 491 964、6 831 982。以金丝桃苷标准溶液浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，所得回归方程为y=685 025x+5 838.9(R2=0.999 8)，表明金丝桃苷在浓度0.625～10.000 μg/mL范围内线性关系良好。

1.3.3金丝桃苷提取率的计算。金丝桃苷提取率=(提取液中金丝桃苷含量×提取液体积×稀释倍数)/贯叶连翘质量×100%。

1.3.4单因素试验。

1.3.4.1辐射温度对金丝桃苷提取率的影响。精密称取贯叶连翘饮片10.00 g 于250 mL烧杯中，设定微波辐射时间9 min、微波功率500 W、料液比1：10，改变辐射温度分别为20、30、40、50、60、70、80 ℃，测定提取液中金丝桃苷的含量，并计算提取率，考察辐射温度对金丝桃苷提取率的影响。

1.3.4.2微波功率对金丝桃苷提取率的影响。精密称取贯叶连翘饮片10.00 g于250 mL烧杯中，设定辐射温度40 ℃、微波辐射时间9min、料液比1：10，改变微波功率分别为300、400、500、600、700、800 W，测定提取液中金丝桃苷的含量，并计算提取率，考察微波功率对金丝桃苷提取率的影响。

1.3.4.3微波辐射时间对金丝桃苷提取率的影响。精密称取贯叶连翘饮片10.00 g于250 mL烧杯中，设定微辐射温度40 ℃、微波功率500 W、料液比为1：10，微波辐射时间分别3、6、9、12、15 min，测定提取液中金丝桃苷的含量，并计算提取率，考察微波辐射时间对金丝桃苷提取率的影响。

1.3.4.4料液比对金丝桃苷提取率的影响。精密称取贯叶连翘饮片10.00 g于250 mL烧杯中，设定辐射温度40 ℃、微波功率500 W、微波辐射时间9 min，改变料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，测定提取液中金丝桃苷的含量，并计算提取率，考察料液比对金丝桃苷提取率的影响。

1.3.5正交设计法优化试验。在单因素试验的基础上，分别以辐射温度(A)、微波功率(B)、微波辐射时间(C)、液料比(D)为试验因素，每个因素设计3个试验水平，采用L9(34)正交设计表(表1)设计试验，并进行方差分析，以获得金丝桃苷提取的最优工艺参数。

表1　正交试验因素水平

2结果与分析

2.1单因素试验结果

图1　辐射温度对金丝桃苷提取率的影响Fig. 1　Effects of radiation temperature on the extraction rate of hyperoside

2.1.1辐射温度对金丝桃苷提取率的影响。由图1可知，随辐射温度增加，金丝桃苷提取率逐渐升高，继续升高辐射温度对金丝桃苷提取率提高不明显。因此，选用50 ℃作为辐射温度的最优值。

2.1.2微波功率对金丝桃苷提取率的影响。由图2可知，在微波功率为500 W之前，随微波功率增加，金丝桃苷提取率逐渐升高，继续升高微波功率超过500 W之后，金丝桃苷提取率进入平台期。因此，选用500 W作为微波功率的最优值。

图2　微波功率对金丝桃苷提取率的影响Fig. 2　Effects of microwave power on the extraction rate of hyperoside

2.1.3微波辐射时间对金丝桃苷提取率的影响。由图3可知，随着微波辐射时间的增加，金丝桃苷提取率逐渐升高，当达到9 min时，金丝桃苷提取率达最大；再增加辐射时间，金丝桃苷提取率下降。因此，辐射时间为9 min是最优值。

2.1.4料液比对金丝桃苷提取率的影响。由图4可知，随着料液比的增加，金丝桃苷提取率逐渐升高，当料液比达1∶20时，金丝桃苷提取率达最大；料液比继续增大时，金丝桃苷提取率增加不明显。因此，料液比优选为1∶20。

图3　微波辐射时间对金丝桃苷提取率的影响Fig. 3　Effects of microwave radiation time on the extraction rate of hyperoside

图4　料液比对金丝桃苷提取率的影响Fig. 4　 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of hyperoside

2.2正交试验结果由表2可知,辐射温度(A)、微波功率(B)、微波辐射时间(C)、料液比(D)4个因素对金丝桃苷提取率的影响程度依次为辐射温度(A)>微波功率(B)>料液比(D)>微波辐射时间(C)，得出最优工艺为A2B1C3D3。

对结果进行方差分析发现，因素A(辐射温度)和因素B(微波功率)的F值均介于F0.01(2，2)和F0.05(2，2)之间， 即0.010.10，料液比对金丝桃苷的提取率无显著性影响。

综上所述,微波法提取贯叶连翘中金丝桃苷的最佳工艺条件为辐射温度50 ℃、微波功率500 W、微波辐射时间9 min、料液比1∶20。

表2　正交试验设计结果

3结论与讨论

应用微波技术提取贯叶连翘中的金丝桃苷，以金丝桃苷提取率为考察指标，采用正交试验法考察辐射温度、微波功率、微波辐射时间及料液比对贯叶连翘中金丝桃苷提取率的影响，建立微波提取贯叶连翘中金丝桃苷的最佳工艺，结果表明，贯叶连翘微波提取金丝桃苷的工艺所选择的4个影响因素对金丝桃苷提取率的影响程度依次为辐射温度>微波功率>料液比>微波辐射时间，微波提取金丝桃苷的最优工艺为辐射温度50 ℃、微波功率500 W、微波辐射时间9 min、料液比1∶20。该试验得到的微波提取工艺条件可靠、稳定性好，可用于贯叶连翘中金丝桃苷的提取。

参考文献

[1] 唐敏，刘耀，夏培元．金丝桃苷对CC14诱导的大鼠肝损伤的保护作用研究[J].中国药房，2011，22(7)：582-586．

[2] 章家胜，陈志武，王瑜，等．金丝桃苷脊髓镇痛作用及机制的研究[J].安徽医学，1998，19(5)：3-5．

[3] 陈红艳，王建华，任振学，等．金丝桃苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的防护作用[J].中西医结合学报，2006，4(5)：526-529．

[4] LI H B, YI X, GAO J M,et al. The mechanism of hyperoside protection of ECV-304 cells against tert-butyl hydroperoxide induced injury [J]. Pharmacolo, 2008,82(2):105-113.

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摘要[目的]优选贯叶连翘中金丝桃苷微波提取工艺。[方法]以金丝桃苷提取率为考核指标，采用正交试验法考察辐射温度、微波功率、微波辐射时间及料液比对贯叶连翘中金丝桃苷提取率的影响，建立微波提取贯叶连翘中金丝桃苷的最佳工艺。[结果]微波提取金丝桃苷的最佳工艺条件为辐射温度50 ℃、微波功率500 W、微波辐射时间9 min及料液比1∶20。[结论]通过以上试验得到的微波提取工艺条件可靠，稳定性好，可用于贯叶连翘中金丝桃苷的提取。

关键词贯叶连翘；金丝桃苷；微波提取；正交试验

Optimization of Microwave Extraction Process of Hyperoside by Orthogonal Test

HU Xiao-yan1, XU Lei1，LI Bo-wen2(1. Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Xuzhou, Jangsu 221004; 2.Shanghai Hile Bio-technology Co., Ltd., Shanghai 201403)

Abstract[Objective] To optimize the optimal microwave extraction process for hyperoside fromHypericumperforatumL. [Method] With the extraction rate of hyperoside as the evaluation index, effects of factors were studied in orthogonal test, such as radiation temperature, microwave power, microwave radiation time and solid-liquid ratio. [Result] The optimal extraction technology for microwave extraction process of hyperoside fromH.perforatumwere established, which was 50 ℃ radiation temperature, 500 W microwave power, 9 min radiation time, and 1∶20 solid-liquid ratio. [Conclusion] This extraction technology was reliable and stable, and was suitable for the extraction of hyperoside fromH.perforatum.

Key wordsHypericumperforatumL.; Hyperoside; Microwave extraction; Orthogonal test

收稿日期2015-12-07

作者简介胡小艳(1980- )，女，陕西西安人，工程师，博士，从事新药开发研究。

中图分类号S 567

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-165-03