滇越金线兰离体快繁及植株再生*

包晴忠，王娟，毕玮，陈芳

(1.西双版纳州林业局，云南　景洪666100；2.云南省林业科学院，云南　昆明650201；

3.国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南　昆明650201)



滇越金线兰离体快繁及植株再生*

包晴忠1，王娟2,3，毕玮2,3，陈芳2,3

(1.西双版纳州林业局，云南景洪666100；2.云南省林业科学院，云南昆明650201；

3.国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201)

摘要：以滇越金线兰野生植株茎段为外植体，分别对其进行诱导、增殖和生根培养基的筛选试验。结果表明，以3/2 MS为基本培养基诱导效果较好；3/2 MS+0.1 mg/L BA+KT 0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA能有效增殖，增殖倍数在5倍；在1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的培养基上生根率达96.4 %以上；在透光度70 %左右的林下开展了组培苗移栽试验，以腐殖土︰珍珠岩︰沙=2︰1︰1配比为组培苗移栽较适宜基质，成活率达85.6 %。

关键词：滇越金线兰；诱导;增殖；生根培养基；茎段；活性炭;透光度；组培苗

滇越金线兰(Anoectochiluschapaensis)是兰科开唇兰属多年生珍稀中草药，植株粗壮(茎粗0.25~0.8 cm)，叶片宽大(长2~5 cm，宽2.5~3.5 cm)，叶片较厚，单株重平均2.5 g以上。金色叶脉清晰，叶面红褐色，4 000 Lx光照强度下呈紫红色，基部鞘状抱茎[1～2]；具有清热凉血、祛风利湿、固肾平肝等功效，近年发现对调节血糖、血脂、血压及尿酸有较好的作用，用于治疗糖尿病、肾炎、急慢性肝病等有显著疗效。最近研究发现，从滇越金线兰中分离鉴定了2个糖苷化的丁酸衍生物，用胰岛素抵抗细胞模型进一步证实，这2个丁酸糖苷化的活性化合物对胰岛素有良好的增敏作用，促进葡萄糖的吸收，有望作为治疗Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的候选化合物加以研究与开发利用[3～5]。由于其较好的药用和观赏价值，野生资源日渐稀少；种子没有胚乳，发芽需有特定真菌，且发芽率在自然条件下只有千分之一[6]。为保护和开发这一宝贵资源，本研究在文山采集野生滇越金线兰进行离体组织培养，建立其无性快繁体系，培育优质种苗，为保护、开发和合理利用资源提供技术支撑。

1材料与方法

1.1　试验材料

野生滇越金线兰材料于2012年9月采自云南文山富宁县田蓬乡大坝子山，以其带节茎段为外植体进行试验。

1.2　试验方法

(1)材料处理外植体剪去叶片和叶柄，中性洗洁精稀释10倍，用软毛刷轻轻刷洗干净，流水冲洗10 min，剪成1~2 cm长的带节茎段，在超净工作台上，先用次氯酸钠消毒20 s，用无菌水冲洗1次，再用0.1 %的HgCl2灭菌10-15 min，用无菌水冲洗3~4次后，用无菌滤纸吸干水分，切去茎段基部，接入诱导培养基中。

(2)诱导基本培养基筛选选用3/2 MS、White、Knudson C进行试验(表1)，添加BA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L，每种培养基接种30个茎段，重复3次，30天后统计诱导培养结果。

表1　不同基本培养基芽诱导结果

表2　不同激素配比对滇越金线兰增殖的影响

表3　不同培养基上滇越金线兰生根效果

(3)增殖培养基筛选以3/2 MS 为基本培养基，添加BA、KT、NAA 3种激素不同浓度及配比进行试验，共设计了9组培养基(表2)。

(4)生根培养基筛选当增殖苗生长到3~4 cm，2~3节时，即可切断进行生根诱导培养，生根培养基设计见表3。

以上培养基加6.0 g/L的琼脂，25 g/L的蔗糖，pH 5.8，在增殖和生根培养基中均添加0.5 %的活性碳，培养温度22~25 ℃，光照强度 3 000 Lx，光照时间 8 h/d。增殖及生根培养基的每个处理接种50瓶，每瓶接种10芽， 50天后统计结果(表2和表3)。

(5)移栽试验移栽滇越金线兰根肉质，根系不发达，无须根，每节一般仅生长1条根，每苗2~3条根，根据以上特点选择以下3种基质进行试验：①腐质土︰珍珠岩︰蛭石=1︰1︰1；②泥土︰珍珠岩=3︰1；③腐质土︰珍珠岩︰沙=2︰1︰1。移栽设在常绿阔叶林下，郁闭度约70 %，林间做床，移栽基质用多菌灵500倍稀释喷洒消毒，把经炼苗处理的试管生根苗揭开封口膜放置3-5天，取出小苗用清水洗净，移栽到备好的托盘中，每种基质移栽500株小苗，定根水淋透后，视天气及基质情况，适时浇水，60天后统计移栽成活情况。

1.3　结果观察及统计

诱导、增殖及生根培养均在接种30-50天后，观察芽及出根情况，芽及根长到0.5 cm以上的进行计数，与接入总数进行百分比计算，分别计算诱导、增殖及生根率。

2结果与分析

2.1　诱导培养基筛选

通过试验，发现滇越金线兰外植体在添加BA 0.1 mg/L +KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L的3/2 MS、White、Knudson C这3种基本培养基中培养，均诱导产生不定芽，诱导率在48 %以上，诱导培养时间在20-28天之间。但不同基本培养基其诱导结果和后续生长情况存在一定差异，其中3/2 MS培养基诱导时间最短(20天)，诱导率(83.3 %)最高，诱导出的侧芽生长健壮，叶色紫褐，金色叶脉明显；White培养基的诱导结果次之；Knudson C培养基的诱导结果较差，虽然Knudson C对其他兰科植物诱导效果较好[7]，但对滇越金线兰不太适宜。结果表明，茎段作为外植体诱导建立无菌快繁体系以3/2 MS培养基为宜。

2.2　增殖培养

植物激素是启动组培芽增殖最灵敏的“钥匙”，添加不同激素和浓度的筛选试验，继代3次，其增殖和生长情况见表2。由表2可知，仅添加BA或KT和NAA 配比的培养基的增殖系数较低，但苗健壮，随其浓度的增加，芽增殖系数逐渐提高，可达6~10倍，但苗纤细；而BA和生长素NAA组合的培养基，比用KT与NAA的培养基的增殖及苗长势较好些，处理4，即0.1 mg/L BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA培养基配比效果最优，芽增殖达5倍，芽20天萌动，形成毛状须根，叶片呈红褐色，金黄色叶脉明显；滇越金线兰继代周期约为70天左右，应及时转接，培养时间过长，芽太长，生长空间不够，营养耗尽，影响长势，继代后需较长时间恢复，影响整个繁育体系的扩增。

2.3　生根培养

生长素IBA及NAA能有效促进植物组织生根，以1/2 MS为基本培养基添加不同浓度和配比的IBA及NAA进行生根筛选试验。

9种培养基均能诱导滇越金线兰生根(表3)，根萌发时间在15-30天，单一生长素对根的诱导培养效果不理想，生根率在36 %~65 %；NAA与IBA的配比效果较好，其最佳浓度及配比为处理4，即1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA诱导时间最短(15天)，生根率达96.4 %，基部3～4节均生根，植株健壮，根每节1条根，偶见2条根，密被根毛，具有典型的兰科植物气生肉质根系特征。

表4　不同移栽基质下滇越金线兰生长效果

2.4　炼苗移栽

本试验采用了3种移栽基质进行滇越金线兰组培苗的移栽试验(表4)，结果表明，在腐殖土︰珍珠岩︰沙=2︰1︰1配比的基质，移栽成活率达85.6 %，植株生长健壮，叶片宽大，增重明显；而在其他2种基质中移栽成活率在51.2 %~73.2 %，植株增重不明显，叶片偏小，特别是泥土和珍珠岩配比的基质，由于通透性较差，根容易腐烂。

3讨论

滇越金线兰喜在阴凉、湿润地方生长，茎干粗壮，叶片宽大，单株生物量平均2.5 g以上。适宜的人工栽培条件下密植有利于提高其单位面积产量，但野生植株体在野外阴湿地区生长，携带大量细菌、真菌等微生物，以致在组培初代培养时，污染率偏高。本试验采用次氯酸钠和HgCl22次灭菌处理外植体，能有效地降低污染率，提高诱导率，无菌体系一旦建立，即可转入增殖培养基中继代培养，可快速建立无菌繁育体系。

本试验发现，滇越金线兰对细胞分裂素比较敏感，添加的 0.5 mg/L BA，即可诱导丛生不定芽，细胞分裂素添加过多，会刺激金线兰基部茎萌蘖大量芽，通过调节激素，诱导腋芽萌发侧芽，切割侧芽，诱导萌发下一级侧芽，从而快速有效地建立起快繁体系，但激素添加过多，丛芽太细，种植后单株产量太低，植株抗逆性差，易得病，应适当控制激素的添加比例，保持适当合理的增殖率。

滇越金线兰很容易生根，添加吲哚丁酸或萘乙酸即可生根，但两者适当比例配比，生根率会得到极大提高；移栽时选疏松、透气、富含有机质的腐质土，能有效地提高其成活率及单位面积生长量。

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Rapid Propagation and Regeneration of Anoectochilus chapaensis in vitro

BAO Qing-zhong1，WAN Juan2,3,BI Wei2,3, CHEN Fang2,3

(1.Forestry Bureau of Xishangbanna, Jinghong Yunnan 666100, P.R.China;2.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;

3.Yunnan Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants,Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;

Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:With the stem segments of wildAnoectochiluschapaensisplants as explants, the experiments on the selection of suitable medium for induction, proliferation and rooting were conducted.The results showed that the suitable induction medium was 3/2MS.When the rooting medium was 3/2 MS+ 0.1 mg/L BA +0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA,it could proliferate 5 times,and when the rooting medium was 1/2 MS +0.5 IBA+0.5 NAA,the rooting rate could reach 96.4 %.Meanwhile, the tests of tissue cultural plantlets transplanting were developed,and it demonstrated that the suitable ratio for mixed material transplanted in forest with 70 % transmittance was peat︰muck︰vermiculite =2︰1︰1, and the survival rate could reach to 85.6 %.

Key words:Anoectochiluschapaensis;induction;rooting medium;stem segment；activated carbon;transmittance;tissue cultural plantlet

通讯作者简介：陈芳(1965-)，女，正高级工程师，主要从事林木组培研究。E-mail:chenfang658@126.com

作者简介：第一包晴忠(1964-)，男，高级工程师，主要从事野生植物保护研究。E-mail:356764757@qq.com

基金项目：国家林业局公益性项目201104060。

*收稿日期：2015-04-12

中图分类号：S 567.2

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2016)01-0021-04