逆灸“天枢”穴干预大鼠结肠组织基因表达谱的实验研究

黄 艳 顾沐恩 翁志军 张建斌 施 茵 马 喆窦传字 刘慧荣, 吴焕淦, 王晓梅 李 璟

(1 上海中医药大学上海市针灸经络研究所，上海，200030； 2 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437； 3 南京中医药大学，南京，210023)

逆灸“天枢”穴干预大鼠结肠组织基因表达谱的实验研究

黄 艳1顾沐恩2翁志军1张建斌3施 茵1马 喆1窦传字1刘慧荣1,2吴焕淦1,2王晓梅1李 璟2

(1 上海中医药大学上海市针灸经络研究所，上海，200030； 2 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437； 3 南京中医药大学，南京，210023)

目的：探讨逆灸“天枢”穴干预对健康大鼠结肠组织基因表达谱的影响，本文首次从转录组学的角度探讨逆灸的作用机制。方法：16只成年的雄性SD大鼠随机分成2组，正常组(NC)、正常+隔药灸组(NM)，采用隔药灸天枢穴(双侧)7 d，在2%戊巴比妥钠麻醉下获取结肠组织。从大鼠的一般状况、体重、结肠组织病理学，观察隔药灸天枢穴对健康的正常大鼠的效应。每组各取3只提取总RNA，采用RNA-seq的高通量测序的方法检测结合生物信息学，分析结肠组织的mRNA表达谱。结果：与NC组比较，隔药灸不导致的健康大鼠体重降低，不影响结肠组织病理学形态观察。与NC组比较，NM组的结肠组织差异表达基因有866个，其中上调604个，下调262个。差异表达基因涉及的基因本体(GO)主要与细胞周期、免疫分子和蛋白质生物过程相关，基因通路(Pathway)主要与机体免疫和蛋白质代谢相关。结论：艾灸“天枢”穴不损伤健康成年大鼠的结肠组织的形态，或能通过影响结肠组织的差异表达基因的生物学过程及通路，调节机体免疫功能而发挥艾灸保健与养生的作用。

逆灸；结肠组织；基因表达谱；炎症性肠病；免疫

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一种慢性非特异性肠道炎性反应性疾病，包括克罗恩病(Crohn′s Disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)，因慢性炎性反应不易治愈，易复发，影响机体对营养物质的吸收，一直是消化道疾病中亟待解决的问题[1]。肠道黏膜感染和正常的吸收和传输障碍，使IBD患者的胃肠传输与健康人不同[2]。结肠是IBD的好发部位，伴有肠道的慢性炎性反应及微生物紊乱[3]。由于IBD发病机制尚未完全阐明，迄今为止，IBD在临床上主要采取药物控制和手术为主的治疗方法，尚缺乏有效的防治措施。

“逆灸”即用灸法保健防病，是针灸“治未病”的主要预处理方法之一。明·高武在《针灸聚英》里说:“无病而先针灸曰逆，逆，未至而迎之也。”中医古籍记载了大量关于“逆灸”防病保健的案例与方法，这种艾灸疗法被现代医家和百姓用以养生，既可预防疾病发生又可既病防变。艾灸激发经络之气，扶助正气，提高机体抵御各种致病因子和应变的能力，调节免疫功能[4]。笔者所在团队前期研究表明，艾灸“天枢”穴可缓解炎症性肠病，调节免疫炎性反应因子[5-8]。本实验采用系统生物学研究方法——转录组学，以雄性SD成年健康大鼠为研究对象，观察艾灸“天枢”穴对机体的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重(180±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养条件：清洁级，12 h昼夜节律交替(上午7点—下午7点照明)，室内温度(20±2)℃，室内湿度50%～70%，适应性饲养1周后开始正式实验。实验严格按照美国国立卫生研究院实验动物的使用指南执行，实验过程中对动物的处置遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2 主要试剂与仪器 NanoDrop-2000(Wilmington，DE，USA)；TRIzol试剂(Life Technologies，Carlsbad，USA)；TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA，USA)；Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA，USA)；Illumina HiSeq 2000 sequencer(Illumina，San Diego，CA，USA)；TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，San Diego，CA，USA)；RNase inhibitor(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL，USA)；实验用小艾条(蕲艾，湖北)。

1.3 艾灸干预 NM组：取天枢穴(双)，穴位的定位参考《实验针灸学，李忠仁》。药饼由中药粉(黄连、附子、肉桂、木香、红花、丹参和当归)结合黄酒混合搅拌成厚糊状，采用模具做成直径1 cm，厚0.45 cm的药饼；采用模具做成直径和高分别为0.6 cm的艾柱，重90 mg。采用固定器固定好大鼠，暴露天枢穴(双)，提前1 d将天枢穴的鼠毛剔除，将做好的艾柱放在药饼的上面，然后将药饼放置天枢穴位上(双)，点燃艾绒，每个穴位每次2个艾柱，每天上午艾灸1次，共干预7次。采用与NM组固定相同的方法NC组的大鼠固定，固定时间相同。

1.4 样本采集 隔药灸干预7 d后，所有大鼠在2%戊巴比妥钠(30～40 mg/kg)麻醉下，在距离肛门1 cm处采集6～8 cm的远端结肠，每个结肠分成2部分，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分剪碎后置于冻存管中，用液氮冻存1 h后保存在-80 ℃冰箱备用。

1.5 结肠的组织病理学观察 将固定于多聚甲醛的24 h的结肠组织取出，清洁修片后脱水包埋，切成4 μm薄片，采用HE染色在光学显微镜下观察结肠的组织病理学变化。

1.6 总RNA抽提、质控及文库构建 每组取3只结肠组织采用Trizol的方法提取结肠组织的总RNA，采用Nanodrop2000检测其纯度和浓度，采用安捷伦2200检测总RNA的完整性，将RIN值大于7的总RNA用于文库构建。每个样本取3 μg总RNA建立小RNA文库，根据Illumina TruSeqTM RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，CA)操作说明分别选取不同的index标签建库。建库完成后利用安捷伦2200检测文库的质量。

1.7 RNA-seq高通量测序和数据分析 本实验采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)试剂在cBot上生成簇，接着在Hiseq2000测序平台上运行单端测序程序。测序过程由Illumian提供的Data collection software进行控制，实时数据分析。与参考序列比对，采用DESeq进行分析，计算变化倍数和P值，设定Fold Change≥2为上调，≤0.5为下调，P值<0.05，并将表达低于0.01的数值过滤掉。

1.8 基因通路分析和GO分析 利用https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp分析了基因本体(Gene Ontology，GO)和基因通路(Pathway)的富集分析，P值<0.05为显著富集。

2 结果

2.1 隔药灸“天枢”穴对大鼠体重及结肠组织形态的影响 大鼠一般情况比较，发现2组大鼠均毛色密集光泽，大便成形，无便血、腹泻，行动活跃、反应灵敏。大鼠在隔药灸“天枢”穴后从第1天到第7天，体重共增加了35 g，正常组增长了33 g。与NC组比较，NM组体重增长差异无统计学意义。见图1。

图1 不同时间点2组大鼠体重比较

注：NC，正常组；NM，正常+隔药灸组。(每组n=8)。

采用光学显微镜进一步观察HE染色后的结肠组织病理学微观变化，NC组与NM组的肠黏膜及腺体结构均完整，排列整齐规则，无充血、水肿及坏死，无浆细胞及中性粒细胞的浸润。见图2。

图2 2组结肠组织病理学比较

注：代表性HE染色(HE，×200)。NC，正常组；NM，隔药灸组。(每组n=8)。

以上通过对体重和组织病理学观察，我们发现隔药灸天枢穴对大鼠的体重及结肠的组织病理学形态无明显影响。

2.2 隔药灸“天枢”穴对大鼠结肠组织基因表达谱的影响 每组取3只大鼠的结肠组织总RNA采用RNA-seq测序，观察隔药灸“天枢”穴对大鼠结肠组织基因表达谱的影响。与NC组比较，NM组的结肠组织差异表达基因有866个，其中上调604个，下调262个。见图3。

采用Cluster3.0和Tree view软件对差异表达的mRNAs聚类分析、热图，直观的比较每组样本之间均一性和组间的差异。2组共6个样本采用hierarchical的聚类方法，分别分析上调和下调的差异表达基因，结果提示NC组和NM组各3个样本的差异表达基因，均按组别聚类。见图4、图5；两个热图中可见每组3个样本的表达较为一致，2组之间有明显的差异。见图4、图5，图4为上调的差异表达基因的聚类分析、热图；图5为下调的差异表达基因的聚类分析和热图。其中，差异表达基因的差异倍数大于10的基因有14个，Gbgt1(FC=62.11)、Klhl14(FC=35.63)、LOC102547612(FC=34.30)、LOC102552171(FC=17.72)、LOC102554698(FC=14.72)、Pnmt(FC=14.07)、LOC102548299(FC=13.71)、LOC103693435(FC=13.67)、Lgsn(FC=12.42)、LOC103694852(FC=11.66)、LOC102551762(FC=11.63)、Crtam(FC=11.60)、LOC102555917(FC=10.52)、LOC684998(FC=10.01)。差异表达基因的差异倍数小于0.01的基因有17个，Hist1h2aa、LOC100361543、LOC100362185、LOC102547455、LOC102552851、LOC102554579、LOC103691297、LOC103692050、LOC103693135、LOC103693516、LOC103693531、LOC103694465、LOC679565、LOC683573、Pabpc1l、Serpinb2、Slc25a21。其中Gbgt1上调了62.11倍，是变化最大的基因。

图3 结肠组织差异表达基因的数目

2.3 隔药灸“天枢”穴对大鼠结肠组织差异表达基因的GO和Pathway的影响 隔药灸影响了NC大鼠结肠组织的mRNAs表达，GO分析结果提示，差异表达基因主要与MHC Ⅰ类蛋白复合物、MHC Ⅰb类蛋白复合物、细胞周期蛋白密切相关，其中上调的604个基因主要与MHC Ⅰ类蛋白复合物、MHC Ⅰb类蛋白复合物、细胞周期蛋白相关；下调的262个基因主要与细胞外的蛋白质基质、分泌颗粒相关。见图6。Pathway分析提示，差异表达基因主要与免疫炎性反应、类固醇和吞噬小体的作用关系密切。上调基因相关的通路有22个，其中主要与TNF-α信号通路、NOD样受体信号传导途径、抗原提呈、Toll样受体信号传导途径、P53信号通路、合成类固醇、吞噬小体相关；下调基因相关通路有4条，其中主要与花生四烯酸代谢、蛋白质的消化与吸收和黏着相关。见图7。

图4 上调差异表达基因的聚类分析和热图

注：与NC组比较，NM组基因表达上调；NC，正常组；NM，正常+隔药灸组。(每组n=3)。

图5 下调差异表达基因的聚类分析和热图

注：与NC组比较，NM组基因表达下调；NC，正常组；NM，正常+隔药灸组。(每组n=3)。

图6 2组差异表达基因的GO分析

图7 2组差异表达基因的Pathway分析

3 讨论

炎症性肠病发病率较高，每年的IBD预防保健费用巨大[9]。目前研究结果表明，炎症性肠病与机体内环境——肠道微生物群的异常免疫应答密切相关，树突状细胞存在调节Th1和Th17细胞介导免疫应答[10]。国外学者Joos观察到针灸对CD和UC均有较好的疗效[11-12]；针灸具有抗炎调节免疫的作用已被证实[13]；研究者所在团队前期开展了隔药灸对CD和UC的临床和实验研究，观察到艾灸对IBD的良好效应，该效应可能与调节了结肠免疫炎性反应因子有关[14-17]。基于前期研究的基础，本研究采用RNA-seq高通量测序技术与方法，从转录组学的角度，探讨艾灸“天枢”穴是否影响健康大鼠结肠组织全基因组表达。

艾灸健康大鼠“天枢”穴对体重及结肠组织形态的均无明显影响，从组织病理学观察未见充血、水肿和炎性反应细胞浸润，表明艾灸不引起对健康大鼠结肠组织形态学改变。然艾灸具有逆灸的保健作用，其机制尚未阐明。本实验从系统生物学转录组学的角度，观察了艾灸对健康大鼠结肠组织的全基因组表达谱的影响。研究结果表明，艾灸能影响结肠组织的基因表达谱，既有上调也有基因下调的差异表达基因，总体上调基因数较下调的基因数多。采用GO和Pathway分析，发现差异表达基因所涉及的主要与细胞周期、机体免疫功能和蛋白质代谢等密切相关。炎性反应对机体感染和损伤的局部组织所呈现的反应，是十分常见而又重要的基本病理过程，相关的免疫因子在结肠的免疫调节扮演重要角色。艾灸调节了多条免疫相关的通路：TNF-α信号通路、NOD样受体信号传导途径、抗原提呈、Toll样受体信号传导途径等。目前研究证实，针灸具有调节免疫发挥抑制炎性反应的作用[13]，同时艾灸不仅能抑制结肠炎[18-20]，也能调节正常大鼠的免疫功能相关的因子，或可防止肠道炎性反应。另外，隔药灸调节了正常大鼠结肠组织P53信号通路，参与细胞周期、蛋白质代谢，或可防止肠道的癌变[21]。

隔药灸调节正常大鼠结肠组织全基因组表达谱，影响多条免疫信号通路，或可调节机体的免疫功能，预防炎症性肠病的发生。后续将进一步观察逆灸“天枢”穴对炎症性肠病的防治作用，以及逆灸“天枢”穴在病理状态的影响的作用机制，以期为逆灸的临床应用提供详实的客观依据。

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(2016-12-07收稿 责任编辑：洪志强)

Genome-wide Gene Expressions under the Effect of Preventative Moxibustion at ST25 in Rats

Huang Yan1，Gu Muen2，Weng Zhijun1,Zhang Jianbin3, Shi Yin1,Ma Zhe1, Dou Chuanzi1,Liu Huirong1,2,Wu Huangan1,2,Wang Xiaomei1, Li Jing2

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMedian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030，China; 2DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China; 3NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

Objective:To investigate genome-wide gene expressions of preventative moxibustion at ST25 in healthy rats. Methods:A total of 16 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the normal group (NC) and the normal and herb-partitioned moxibustion group (NM). Starting from day 1, the NM group received herb-partitioned moxibustion at the Tianshu points (bilateral, ST25) for 7 days. On day 8, colon tissues were collected under anesthesia with 2% pentobarbital sodium. The effect of herb-partitioned moxibustion at the ST25 in rats was observed on the general conditions, body weights, and HE staining. Three samples from each group were selected for total RNA extraction. The gene expression profile in the colon tissues was analyzed by the RNA-seq combined with bioinformatics. Results:Compared with the NC group, herb-partitioned moxibustion did not take effect on weight and histopathological observation of the colon in healthy rats. The NM group had 866 differentially expressed genes in colon tissues compared to the NC group, of which 604 were up-regulated and 262 were down-regulated. KEGG pathway analysis indicated that these genes were involved in multiple pathways, including immunity and protein metabolism. Conclusion:Herb-partitioned moxibustion at ST25 alters genome-wide gene expressions in healthy rats, and affects the biological processes and pathways. The treatment can be used as a healthcare treatment against diseases.

Preventative moxibustion; Colon tissue; Gene expression profiling; Inflammatory bowel disease

国家重点基础研究发展计划(”973”计划)项目(编号：2009CB522900；2015CB554501)；国家自然科学基金青年项目(编号：81503659);中国博士后科学基金面上项目(编号：2015M570380)；上海市针灸机制与穴位功能重点实验室资助(编号：14DZ2260500)；上海市重点学科资助项目(编号：S30304-A17)

王晓梅，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：针灸胃肠疾病的临床与基础；李璟，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：针灸胃肠疾病的临床与基础研究

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.010