肌源性干细胞研究进展

牛丽丽毕力格巴图牧仁肖瑞王忆霄姜丽丽温建勋王秀娟边艳超

1.内蒙古医科大学分子病理学重点实验室;2.内蒙古自治区农牧业杂志社; 3.内蒙古师范大学生命科学与技术学院

肌源性干细胞研究进展

牛丽丽1毕力格巴图2牧仁3肖瑞1王忆霄1姜丽丽1温建勋1王秀娟1边艳超1

1.内蒙古医科大学分子病理学重点实验室;2.内蒙古自治区农牧业杂志社; 3.内蒙古师范大学生命科学与技术学院

近年来，具有巨大临床应用潜能的成体干细胞已经成为生命科学研究的热点之一。肌源性干细胞具有强大的自我更新和多项分化潜能，能分化为神经细胞、胰岛细胞、成骨细胞等不同胚层的细胞，并能参与多种组织的损伤修复过程，在脊髓损伤修复及治疗压力性尿失禁中发挥巨大作用，因此，在基因治疗和组织工程领域具有广泛应用前景。

肌源性干细胞 更新 分化 损伤修复

近年来，具有巨大临床应用潜能的成体干细胞已经成为生命科学研究的热点之一。肌源性干细胞（muscle-derived stem cells,MDSCs），是肌肉来源的多能干细胞的一个通称，它的具体组分、不同组分之间的确切关系尚未确定，具有强大的自我更新和多项分化潜能，在适当的条件下不仅能分化为中胚层细胞类型，如：成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞和造血谱系，还可以打破胚层的限制分化为外胚层和内胚层的细胞类型[1-2]，并参与多种组织的损伤修复过程，在基因治疗和组织工程领域具有广泛应用前景。

一、肌源性干细胞的分离纯化

1999年Jackson等[3]报道，利用Hoechst/流式细胞仪法从小鼠骨骼肌中分离到一群与卫星细胞明显不同的干细胞,这些细胞表达造血干细胞的表面标志,能有效重建造血功能,说明这种具有分化多能性的肌源干细胞与肌肉干细胞或卫星细胞是两种不同的细胞。Gussoni E等在Nature杂志上也报道了用Hoechst/FACS方法纯化MDSCs的方法，即3～5周龄小鼠骨骼肌中消化分离出的细胞，经Hoechst33342染色，用FACS方法富集到MDSCs，移植到致死照射处理的小鼠体内能有效重建造血系统。Lee等[4]（2000）、Jankowski等[5](2001)、Qu-Petersen等[6]（2002）用差速贴壁法从正常的骨骼肌中分离出三个细胞亚群：成纤维细胞很快在PP1和PP2培养板中贴壁，称之为早期贴壁细胞群；PP3和PP4细胞贴壁稍慢，其主要成分为肌卫星细胞，称之为晚贴壁细胞群；PP5和PP6贴壁速度很慢，称为慢贴壁细胞群，此细胞群为一种新的细胞群，其具有很高的分化潜能，称之为肌源性干细胞。

国内也有相关的报道，张金明等[7]（2006）采用差速贴壁分离技术，分别用Ⅺ型胶原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化肌肉，得到了兔的MDSCs；迟猛等[8]（2008）采用消化法和差速贴壁法分离纯化得到了人的MDSCs；韩颖等[9]（2008）使用胶原酶消化牛骨骼肌，然后采用差速贴壁分离技术纯化获得牛的MDSCs。

二、肌源性干细胞的表面标志

干细胞表面特异性分子标志，是区分不同干细胞的主要依据，肌源性干细胞的表面标志已被初步认识，但其结果具有很大差异，这些不同的结果可能是由于各实验室的条件、细胞分离培养方法及分析方法不同所造成。Lee[4-10]等通过免疫组化、PT-PCR和流式细胞术等方法分析MDSCs表达标记，发现其表达肌源标志Desmin、Bcl-2、C-met，和干细胞标志Sca-1、CD34，但不表达C-kit、CD45。Torrente[11]等报道MDSCs虽然也表达Sca-1、CD34，但不表达Desmin。Zhuqing Qu[12]等发现60%的原代MDSCs不表达Desmin，而传代培养时Desmin阳性细胞逐渐增加。我们注意到造血干细胞的表达标志如Sca-1、CD34也在MDSCs表达，而有些肌细胞的标记却不被MDSCs表达，这种现象说明当干细胞的全能性增加，其组织特异性标志减少,而不同组织来源的干细胞共有的标志增多。

pax7是一个促进MDSCs向卫星细胞分化的重要因子[13]。Olguin和Zammit等发现Pax7可以调节卫星细胞的繁殖和自我更新[14-15],对卫星细胞的功能起重要作用[16]。Pax7在MDSCs与卫星细胞表达有所不同[17-18]，pax7-/-的小鼠中完全缺乏卫星细胞而MDSCs数不受影响，说明MDSCs与卫星细胞是两种不同的细胞。

三、肌源性干细胞的分化潜能

MDSC具有多向分化潜能，在适当的营养素和生长因子的作用下能分化为不同胚层的细胞，如造血细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。但MDSCs的分化机制尚不清楚，可能与细胞融合有关，因此也是目前研究的热点。

1.MDSCs向神经细胞分化

睫状神经因子作为一种神经营养因子，通过细胞表面的受体可以使得成肌细胞去分化而转变为多能干细胞；丹参也具有诱导多能干细胞向神经细胞分化的功能，但具体机制尚不明确。曾祥一等（2009）应用差速贴壁法和酶消化法获得MDSCs后接种于6孔板内，诱导组用含有睫状神经营养因子的DMED预诱导24h，更换培养液，洗涤3次，再加入含丹参注射液的无血清DMEM诱导5h；对照组使用无血清DMEM培养基处理。结果显示诱导前MDSCs未见神经丝蛋白表达，诱导后的神经元样细胞神经丝蛋白呈阳性表达；凝胶电泳及Western blot检测结果显示，与诱导前比较，诱导后对照组核因子kB抑制蛋白的表达无明显变化，诱导组核因子kB抑制蛋白的表达明显下降[19]。

李进等[20]（2008）从成年SD大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞，采用bFGF、EGF诱导出神经球样细胞团，并检测nestin免疫组化染色示强阳性。在再贴壁培养下，用RA、BDGF诱导分化，部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态，并表达NSE、GFAP。为治疗臂丛神经根性撕脱伤及其它中枢神经损伤提供了一种新方法。

2.MDSCs向胰岛素分泌细胞分化

刘福强等用大鼠胰腺提取液（RPE）诱导MDSCs向胰岛素分泌细胞分化，通过形态学观察、双硫腙（DTZ）染色、免疫细胞化学显色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定，结果显示RPE诱导后第5日有胰岛样结构出现；免疫细胞化学显示，诱导后第12日细胞团表达胰岛素、胰高血糖素，而未诱导组细胞不表达上述蛋白；RT-PCR结果表明，诱导后第6日检测到PDX-1的表达，诱导后第12日检测到胰岛素1、胰岛素2、胰高血糖素和葡萄糖转运体2基因的表达。说明大鼠MDSCs可定向分化为胰岛素分泌细胞[21]。

3.MDSCs向成骨细胞分化

肌肉中骨祖细胞的存在和MDSCs分化为成骨细胞的能力有效地促进了骨的愈合。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）是TGF-β超家族的成员，广泛分布于动物骨组织的酸性蛋白质，在人类基因组中发现的BMP家族有20多个成员。BMP-2是已知的所有生长因子中对骨的形成最强的生长因子，对骨组织形成、生长和修复有促进作用[22]。经BMP-2诱导的人MDSCs形态发生显著变化，出现了胞体肥大并呈圆形的细胞，这些肥大的圆形细胞经检测证实，其胞体内有ALP、骨钙素的表达，说明MDSCs能向成骨细胞转化，且随着BMP-2剂量的增加，ALP、骨钙素含量相应增加[23]。Kuroda等[24]的研究表明由MDSCs的BMP-4的局部传递增强了小鼠的软骨形成并促进了关节软骨的修复。Peng等[25]研究发现VEGF与BMP-4能协同作用促进骨的愈合，但如果两种因子的比例不当，将对骨愈合产生有害的结果。W right等[26]用编码BMP-4的反转录病毒体外转染人MDSCs，移植到免疫力正常的小鼠后，成骨量少于SCID小鼠。Alden等[27]认为，表达BMP-2的腺病毒转染MDSCs异体移植成骨存在免疫反应。避免或减轻免疫反应，改进并简化MDSCs的分离和纯化方法，过渡到自体细胞移植是尚待解决的重要问题。

四、肌源性干细胞在基因治疗与组织工程中的应用

1.在脊髓损伤修复中的应用

常用于脊髓损伤修复的种子有胚胎神经干细胞、嗅鞘细胞、骨髓基质干细胞等，这些细胞移植至脊髓损伤区均能使损伤再生或修复，但都有其各自的缺点和不足。MDSCs具有诱导分化为神经细胞的潜能，并能向神经干细胞一样在中枢神经组织里迁移和整合；自体移植又克服了伦理学争议和排斥反应等问题，是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子细胞。

目前，干细胞移植治疗脊髓损伤的机制尚不清楚，一般认为：①干细胞在适合的环境条件下具有分化为神经细胞的潜能，神经细胞从结构上修复脊髓损伤。②植入的干细胞与定居部位神经组织间相互作用，并产生某些细胞因子，这些细胞因子不仅能促进神经功能的修复，也能保障植入干细胞的存活、增殖，并诱导神经细胞向受损部位迁移。③干细胞本身也可以作为填充物填补损伤部位，定向再生为神经细胞锚靠周围组织完成上行下传功能的重建，移植时创造抑制胶质细胞再生、保护神经细胞体存活、促进自体神经细胞再生的微环境。④干细胞具有向血管内皮祖细胞和神经细胞方向分化的作用，有利于受损区神经和血管组织的修复[28]。⑤减少损伤区的细胞凋亡。⑥抑制T细胞的增殖等[29-30]。

2.在治疗压力性尿失禁中的应用

全世界约有20亿人患有尿失禁，其严重影响了人们的生活质量。压力性尿失禁是尿失禁中最常见的一种类型，且发病率越来越高[31]。发生压力性尿失禁的机制主要是尿道括约肌结构及功能缺陷和膀胱颈支撑功能障碍。传统的治疗方法只能取得短期的疗效，不能从本质上纠正成肌功能障碍，而且还会引起慢性炎症反应，尿道周围脓肿、糜烂，及尿道阻塞而引起尿潴留，内脏器官偏移和肺栓塞等不良反应[32]。

目前，治疗压力性尿失禁的最新方法就是应用干细胞移植技术。在干细胞移植术中，所应用的干细胞必须具有较强的增殖能力。MDSCs是肌肉内高度未分化的多潜能干细胞，增殖快、融合慢、分化能力强存活率高等优点，是治疗压力性尿失禁的一种理想的种子细胞。

Atalad等[33]最早报道了在一猪模型应用培养的自体软骨细胞治疗压力性尿失禁，他们还研究了使用人膀胱平滑肌细胞和尿道细胞在生殖泌尿重建中作组织替代[34]。Lee JY等[35]报道在一尿失禁模型注射肌肉干细胞和胶原，在注射后第四周肌肉干细胞和胶原具有相似的改善LPP和逼尿肌压力的作用，但在移植后12周，胶原的作用明显减弱而肌肉干细胞的作用持续。Peyromaur M等[36]研究了正常大鼠尿道肌源性细胞移植的存活和分化，发现移植后细胞可长期存在和分化。研究表明用人的肌源性干细胞治疗妇女的压力性尿失禁，与传统的治疗方法相比较取得了良好治疗效果，但其具体的细胞移植数量和试验中存在的随机性还有待进一步研究[37]。

五、展望

近年来，随着高新技术的发展、分子生物学的应用和学科间的相互渗透，使基因治疗和组织工程修复等的研究获得了迅猛发展，特别是成体干细胞在组织修复中的应用得到高度重视。肌源性干细胞取自自体，具有较强的自我更新能力和高度的可塑性，且不需要免疫抑制剂，也不存在伦理问题，因此在临床上具有广泛的应用前景。

[1]张萍，马月辉，焦淑清，等.肌源性干细胞的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2015,08∶64-66.

[2]Xiaoyun W u,Shili Wang,Baoli Chen,et al. Muscle-derived stem cells∶isolation,characterization, differentiation,and application in cell and gene therapy[J].Cell and Tissue Research,2010,340(3),549-567.

[3]Jackson KA,M i T,Goodell MA.Hematopoietic potention of stem cells isolated from murine skeletal muscle[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(25)∶14482-6.

[4]Lee J,Qu-Petersen B,Cao S,et al.Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing[J].JCell Biol,2000,150 (5)∶1085-1000.

[5]Jankowski RJ,Haluszczak C,Trucco M,et al.Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique∶potential for rapid isolation of muscle-derived stem cel[J].Hum Gene Ther,2001,12(6)∶619-28.

[6]Qu-Petersen Z,Deasy B,Jankowski R,et al. Identification of a novel population of muscle stem cells in m ice∶potential for muscle regeneration[J].J Cell Biol,2002,157(5)∶851-64.

[7]张金明,何涛,梁伟强,等.兔肌源性干细胞的生物学特性及表型研究[J].中国病理生理杂志，2006,22(11)∶2239-2243.

[8]迟猛,韩剑峰,方波.人肌源性干细胞的培养与鉴定[J].中国现代药物应用，2008,2(14)∶61-62.

[9]韩颖,孔庆然，尹智，等.牛肌源性干细胞的培养和鉴定[J].东北农业大学学报，2008,39(12)∶47-50.

[10]Montanaro F.,Liadaki k.,et al.Demystifying SP cell purification∶viability,yield,and phenotype are defined by isolation parameters[J].Exp Cell Res, 2004,298(1)∶144-154.

[11]Torrente Y,Cam irand G.,et al.Identification of a patlway for the muscle hom ing of stem cells in a muscular dystrophy model[J].JCell Biol,2003,162(3)∶511-520.

[12]Qu Z,Balkir L,et al.Development of Approaches to Improve Cell Survival in M yoblast TransferTherapy[J].JCell Biol,1998,142(5)∶1257-1267.

[13]Seale P,Sabourin LA,Girgis-Gabardo A,et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells[J].Cell,2000,102∶777-786.

[14]O lguin HC,O lw in BB.Pax-7 up-regulation inhibits myogenesis and cell cycle progression in satellite cells∶a potential mechanism for self-renewal [J].Dev.Biol.2004,275∶375-388.

[15]Zamm it PS,Golding JP,Nagata Y,et al.M uscle satellite cells adopt divergent fates∶a mechanism for self-renewa[J].JCell Biol,2004,166∶347-357.

[16]Seale,P.,and Rudnicki,M.A new look at the origin,function,and"stem-cell"status of muscle satellite cells[J].Dev Biol,2000,218∶115-124.

[17]M cLoon L K,W irtschafter J.Activated Satellite Cells in Extraocular Muscles of Normal Adult Monkeys and Humans[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003,44(5)∶1927-1932.

[18]M cCroskery S,Thomas M,et al.M yostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal[J].J Cell Biol,2003,162(6)∶1135-1147.

[19]曾祥一，王伟，孙亮，等.睫状神经营养因子和丹参注射液体外诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13（27）∶5336-5340.

[20]李进，洪光祥，康皓，等.成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化[J].华中科技大学学报（医学版）,2008,37(4)∶443-448.

[21]刘福强，刘畅，杨彪，等.大鼠胰腺提取液体外诱导肌源性干细胞分化为胰岛素分泌细胞[J].解剖学杂志，2008,31(5)∶629-632.

[22]於丽明，王佐林.BMP-2诱导骨骼肌成骨的研究进展[J].口腔颌面外科杂志，2008,18(4)∶300-303.

[23]姜横滨，韩剑锋，方波.人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2008,29(6)∶674-675.

[24]Kuroda R,Usas A,Kubo S,et al.Cartilage repair using bone morphogenetic protein 4 and musclederived stem cells[J].Arthritis Rheum,2006,54(2)∶433.

[25]孙杰，王世立，韩金祥.肌源干细胞及其应用研究进展[J].生物技术通讯，2006,17(6)∶950-952.

[26]W right V,Peng H,Usas A,et al.BMP4-expressing MDSCs differentiate into osteogenic lineage and improve bone healing in immunocompetent m ice[J]. M ol Ther,2002,6(2)∶169-178.

[27]Alden TD,Pittman DD,Hankins GR,et al.In vivo endochondral bone formation using a home morphogenetic protein-2 adenoviral vector[J].Hum Gene Ther,1999,10∶2245-2253.

[28]Lu P,JonesLL,Snyder EY,et al.Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal grow th after spinal cordinjury[J].Transplantation,2003,75(3)∶389-397.

[29]Tse W T,Pendleton JD,Beyer WM,et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells∶implications in transplantation[J].Transplantation,2003,75(3)∶389-397.

[30]杨彪，刘福强，梅晰凡.肌源性干细胞及其在脊髓损伤修复中的应用前景[J].医学综述,2008,14（(3)∶323-325.

[31]Norton P,Brubaker L.Urinary incontinence in women.Lancet,2006,367∶57-67.

[32]Kiilholma P,Chancellor MB,Makinen J,et al. Complications of Teflon injections for stress urinary incontinence[J].Neurourol U rodyn,1993,12∶131-137

[33]Atala A,Kim W,Paige KT,et al.Endoscopic treatment of vesicoureteral refluxw ith a chondrocytealginate suspension[J].JUrol,1994,152∶641-3.

[34]Atala A,Freeman MR,Vacanti JP,et al. Implantation in vivo and retrieval ofartificial structures consisting of rabbit and human urothelium and human bladder muscle[J].JUrol.1993,150∶608-12.

[35]Lee JY,Paik SY,Yuk SH.Long Term Effect of Muscle-derived Stem Cells on Leak Point Pressure and Closing Pressure in Rats w ith Transected Pudendal Nerves[J].Mol Cells,2004,18(3)∶309-313。

[36]Peyromaure M,Sebe P,Praud C.ate of implanted syngenic muscle precursor cells in striated urethral sphincter of female rats∶Perspectives for treatment of urinary incontinence[J].Urol,2004,64(5)∶1037-1041.

[37]LK Carr,D Steele,S Steele,et al.1-year follow-up of autologous muscle-derived stem cell injection pilot study to treat stress urinary incontinence[J].Int U rogynecol J,2008,19∶881-883.